HPLC法測(cè)定“長(zhǎng)林”系列油茶籽種仁中2個(gè)主要黃酮苷含量

李海琳 劉京晶 朱國(guó)華 王軍峰 潘心禾

（浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地天然藥物研發(fā)中心1，臨安 311300）

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所茶樹資源與改良研究中心2，杭州 310008）

（麗水市林業(yè)技術(shù)推廣總站3，麗水 323000）

（麗水市林業(yè)科學(xué)研究院4，麗水 323000）

油茶（Camellia oleifera Abel.），系山茶科山茶屬植物中油脂含量較高且有栽培經(jīng)濟(jì)價(jià)值的一類植物的總稱[1]，是我國(guó)特有的木本油料樹種，具有很高的食、藥用價(jià)值。除水分外，油茶籽種仁主要由油分、淀粉、蛋白質(zhì)、多糖、多酚類物質(zhì)、黃酮類化合物、茶皂素和粗纖維組成，還有少量鞣質(zhì)和灰分[2]。其中，黃酮類物質(zhì)在抗氧化活性、防止皮膚疾病、增強(qiáng)免疫力和預(yù)防心血管疾病等方面具有重要的生物活性與功效，廣泛應(yīng)用于食品、藥品、化妝品等產(chǎn)品中[3-5]。通常采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測(cè)定總黃酮含量，李姣娟等[6]、姜天甲等[7]分別用此方法測(cè)定了油茶葉和油茶籽殼中總黃酮含量；陳詩(shī)強(qiáng)等[8]采用三氯化鋁比色法測(cè)油茶籽中總黃酮含量；李利敏等[9]采用紫外直接測(cè)定法測(cè)定了油茶蒲中總黃酮含量。本研究從油茶餅粕中自制2種高純度黃酮苷作為對(duì)照品，建立其高效液相色譜含量測(cè)定方法。采用正交試驗(yàn)法優(yōu)化了油茶籽種仁中2個(gè)單體黃酮苷的最佳提取工藝，并測(cè)定“長(zhǎng)林”系列11個(gè)油茶品種。本研究的方法和結(jié)果為科學(xué)評(píng)價(jià)“長(zhǎng)林”系列油茶提供參考，為油茶新品種選育及相關(guān)功能性食品或藥品的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

“長(zhǎng)林”系列11個(gè)品種油茶種籽均于2011年10月份采自浙江省麗水市油茶種質(zhì)資源庫(kù)，剝除果皮和種殼，種仁于60℃干燥箱中烘干，粉碎過(guò)10目篩，干燥器中保存。除長(zhǎng)林180號(hào)外，其余均已通過(guò)國(guó)家或省級(jí)良種審定[10]。

黃酮苷Ⅰ和黃酮苷Ⅱ?qū)φ掌罚鹤灾?，?jīng)面積歸一法檢測(cè)純度均大于98%；色譜乙腈：美國(guó)TEDIA天地試劑公司。

Agilet1200高效液相色譜儀：Agilent公司，含四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、二極管陣列檢測(cè)器。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 油茶籽種仁提取方法的優(yōu)化

1.2.1.1 提取方式的選擇

通過(guò)比較油茶籽種仁中黃酮苷Ⅰ和黃酮苷Ⅱ的測(cè)定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的回流提取法比超聲提取法要高，油茶籽種仁脫脂與否對(duì)2個(gè)主要黃酮苷含量測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著影響，所以選擇不脫脂直接回流提取的方式。

1.2.1.2 提取溶劑的選擇

稱取油茶籽種仁粉末0.2 g，分別用50%、80%、100%的甲醇，50%、80%、100%的乙醇，50%的丙酮溶液20 mL作提取溶劑，于80℃水浴回流提取1 h，結(jié)果表明，50%甲醇溶液作提取溶劑時(shí)，黃酮苷Ⅰ和黃酮苷Ⅱ含量最高，所以初步選擇50%甲醇溶液作為提取溶劑。

1.2.1.3 正交試驗(yàn)的設(shè)計(jì)

在提取方式和提取溶劑選擇的基礎(chǔ)上，進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。采用回流提取方式，稱取0.2 g長(zhǎng)林55號(hào)油茶籽種仁粉末于100 mL圓底燒瓶中，選取甲醇濃度、料液比、提取溫度、提取時(shí)間為影響因素，按照L9（34）正交表設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平及編碼見(jiàn)表1，運(yùn)用高效液相色譜儀記錄油茶籽種仁提取液中2個(gè)主要黃酮苷的峰面積，計(jì)算2個(gè)黃酮苷的含量并以此作為考察指標(biāo)，確定2個(gè)黃酮苷的最佳提取方法。

表1 因素水平表

1.2.2 2個(gè)單體黃酮苷的HPLC含量測(cè)定

1.2.2.1 色譜條件

色譜柱：VenusilMPC18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相：0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），線性梯度洗脫：0～30 min，5%～30%B；柱溫25℃；流速1.0 mL／min，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm；進(jìn)樣量10μL。在此條件下，2種成分的理論塔板數(shù)不低于20 000。

1.2.2.2 對(duì)照品的制備和鑒定

黃酮苷Ⅰ和黃酮苷Ⅱ的結(jié)構(gòu)鑒定：從油茶餅粕中分離出的2個(gè)單體黃酮苷，經(jīng)UV、H-NMR、CNMR、MS等數(shù)據(jù)分析，與文獻(xiàn)[11]比對(duì)一致，鑒定為山奈酚-3-O-｛β-D-吡喃葡萄糖基-（1→2）-[α-L-吡喃鼠李糖基-（1→6）]-β-D-吡喃葡萄糖苷｝（Ⅰ）和山奈酚-3-O-｛β-D-吡喃木糖基-（1→2）-[α-L-吡喃鼠李糖基 -（1→6）]-β-D-吡喃葡萄糖苷｝（Ⅱ），結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。

圖1 黃酮苷Ⅰ和黃酮苷Ⅱ結(jié)構(gòu)式

對(duì)照品溶液的配制：稱取黃酮苷Ⅰ和黃酮苷Ⅱ?qū)φ掌愤m量，用甲醇配成質(zhì)量濃度分別為0.53 mg／mL和0.52 mg／mL的混合溶液，置冰箱中備用。

1.2.2.3 供試品溶液的制備

稱取油茶籽種仁粉末0.2 g，置于100mL圓底燒瓶中，精密加入10 mL 80%甲醇，稱定質(zhì)量，于80℃水浴回流提取1 h，放冷稱定，補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45μm有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

1.2.2.4 線性關(guān)系考察

吸取對(duì)照品溶液0.5、1、2、4、8、10、15μL注入高效液相色譜儀，依據(jù)上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍

1.2.2.5 方法學(xué)考察

1） 精密度試驗(yàn)

吸取對(duì)照品溶液10μL按1.2.2.1色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果表明，黃酮苷Ⅰ和黃酮苷Ⅱ峰面積的RSD分別為0.89%和0.76%，表明儀器精密度良好。

2） 穩(wěn)定性試驗(yàn)

吸取同一供試品溶液10μL，按1.2.2.1色譜條件，依次在0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣，結(jié)果黃酮苷Ⅰ和黃酮苷Ⅱ峰面積的RSD分別為0.37%和0.43%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3） 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取同一批樣品（長(zhǎng)林3號(hào)）6份，分別按2.2.3制備供試品溶液，按1.2.2.1色譜條件測(cè)定。結(jié)果，黃酮苷Ⅰ和黃酮苷Ⅱ峰面積的RSD分別為1.04%和1.07%，表明方法重復(fù)性良好。

4） 回收率試驗(yàn)

取0.1 g已知含量的樣品9份，精密稱定，分別精密加入高、中、低3個(gè)劑量的黃酮苷Ⅰ和黃酮苷Ⅱ?qū)φ掌啡芤?，?.2.2.1色譜條件進(jìn)行測(cè)定。加樣回收率按以下公式計(jì)算：

回收率＝（實(shí)測(cè)量-樣品中含量）／加入對(duì)照品量×100%

2個(gè)對(duì)照品成分加樣回收率分別為97.3%～98.9%（RSD＜1.95%）和96.8%～98.9%（RSD＜1.55%），結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 “長(zhǎng)林”系列油茶籽種仁中2個(gè)單體黃酮苷的加樣回收率

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4，由表4可知，4個(gè)因素對(duì)2個(gè)黃酮苷含量的影響大小均為：甲醇體積分?jǐn)?shù)＞液料比＞提取溫度＞提取時(shí)間，并且甲醇體積分?jǐn)?shù)50%，料液比1∶50，提取時(shí)間90 min，提取溫度80℃時(shí)測(cè)得2個(gè)黃酮苷含量最高。結(jié)合方差分析和顯著性檢驗(yàn)可知，甲醇濃度對(duì)黃酮苷提取影響極顯著，但在50%和80%水平時(shí)差異不顯著，考慮到50%提取液略顯乳濁狀，故甲醇體積分?jǐn)?shù)定為80%；液料比對(duì)2個(gè)黃酮苷的提取影響極顯著，仍定為測(cè)得含量最高的1∶50；提取時(shí)間對(duì)2個(gè)黃酮苷的提取影響不顯著，故60 min較為合適；提取溫度對(duì)黃酮苷Ⅰ的提取影響不顯著，對(duì)黃酮苷Ⅱ的提取影響顯著，80℃有利于2個(gè)黃酮苷的提取。所以最終確定2個(gè)黃酮苷的最佳提取工藝為A2B3C1D2，即甲醇體積分?jǐn)?shù)80%，料液比1∶50，提取溫度80℃，提取時(shí)間60 min。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2 HPLC含量測(cè)定結(jié)果與分析

按1.2.2.1色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算“長(zhǎng)林”系列11個(gè)不同品種油茶籽種仁中黃酮苷Ⅰ和黃酮苷Ⅱ的含量，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，2個(gè)黃酮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.28%～2.98%和1.42%～2.37%，在不同品種油茶中存在顯著差異，其中黃酮苷Ⅰ以長(zhǎng)林53號(hào)、55號(hào)和21號(hào)最高，長(zhǎng)林40號(hào)次之，長(zhǎng)林23號(hào)最低；黃酮苷Ⅱ以長(zhǎng)林4號(hào)、27號(hào)和18號(hào)最高，長(zhǎng)林23號(hào)次之，長(zhǎng)林180號(hào)、53號(hào)最低。油茶籽種仁中總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.57%～4.69%，以長(zhǎng)林4號(hào)、21號(hào)和55號(hào)最高，長(zhǎng)林18號(hào)最低。2個(gè)黃酮苷含量呈顯著負(fù)相關(guān)，2個(gè)主要黃酮含量的總和分別與2個(gè)單體黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)沒(méi)有顯著相關(guān)性，可見(jiàn)不能以某一單體黃酮的含量代表該品種油茶籽的黃酮總體含量情況。

由HPLC圖（譜圖2b）可明顯看出油茶籽種仁中最主要的黃酮苷類成分為黃酮苷Ⅰ和黃酮苷Ⅱ，李海琳等[12]前期研究中對(duì)油茶籽種仁的總黃酮采用通用的亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法，結(jié)果質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.53%～1.06%，低于本研究HPLC法所測(cè)2個(gè)黃酮苷含量總和（3.57%～4.71%）。原因是油茶籽種仁中以山奈酚為母核的黃酮苷類化合物不能與亞硝酸鈉-硝酸鋁試劑反應(yīng)生成黃色絡(luò)合物（以黃酮苷Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行該顯色反應(yīng)試驗(yàn)，以溶劑為空白對(duì)照，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值約為0），因此，以蘆丁為對(duì)照品的亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法不能準(zhǔn)確定量油茶籽種仁中總黃酮含量。

圖2 對(duì)照品和油茶籽種仁的HPLC圖

3 結(jié)論

本研究考察了提取方式（超聲提取、回流提?。?duì)2個(gè)黃酮苷提取得率的影響，結(jié)果表明回流提取的效果明顯高于超聲提取。繼而設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，選擇80%甲醇溶液，料液比1∶50，溫度80℃，回流提取時(shí)間1 h為油茶籽種仁中主要黃酮苷的最佳提取工藝。采用Venusil MP C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色譜柱，乙腈 -0.1%磷酸水溶液流動(dòng)相，線性梯度洗脫，流速1.0 mL／min，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm，柱溫25℃，建立了2個(gè)主要黃酮苷的HPLC含量測(cè)定方法。結(jié)果表明11個(gè)品種油茶籽種仁中黃酮苷Ⅰ質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.28%～2.98%，黃酮苷Ⅱ質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.42%～2.37%。本試驗(yàn)建立的HPLC法專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，可用于油茶品種間黃酮含量的品質(zhì)評(píng)價(jià)。

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