小麥粉中蟲卵的快速檢測技術(shù)的研究與比較

劉鳳杰 何向楠 王爭艷 莊義捷 王文鐸 鄭學(xué)玲 魯玉杰

（河南工業(yè)大學(xué)分析測試中心1，鄭州 450002）

（河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院2，鄭州 450002）

小麥粉中昆蟲蟲卵的檢測在小麥粉的進(jìn)出口貿(mào)易中，是一項重要指標(biāo)，建立一種快速檢測小麥粉中昆蟲蟲卵含量的方法是小麥粉產(chǎn)業(yè)中有待解決的問題[1]。

目前國內(nèi)外對小麥粉中蟲卵的檢測主要用染色法[2-3]，浮選法[4]、尿酸法[5]、幾丁質(zhì)法[6]。浮選法已在美國AOCC中有詳細(xì)說明，它是針對小麥粉中害蟲碎片的檢測，本研究用于蟲卵的檢測，判斷其可行性。

尿酸是昆蟲嘌呤代謝的主要終產(chǎn)物，為三氧基嘌呤，其醇式呈弱酸性，其合成是昆蟲代謝途徑的重要研究內(nèi)容[7]。昆蟲分泌的尿酸作為氮代謝的最終產(chǎn)物，已用于昆蟲污染的指示物來檢測籽粒及谷物產(chǎn)品中昆蟲的數(shù)量[8]。幾丁質(zhì)（Chitin）是昆蟲體壁主要化學(xué)成分，占表皮干重的20%～50%[9]。在高溫和堿性條件下，幾丁質(zhì)脫去乙酰胺基形成幾丁糖，而幾丁糖經(jīng)碘和稀酸作用后呈紫色。純小麥粉中不存在幾丁質(zhì)，本試驗根據(jù)該原理利用幾丁質(zhì)的檢測方法來檢測小麥粉中是否含有蟲卵。染色法在生物科研領(lǐng)域應(yīng)用較多且較為成熟，但在儲藏物害蟲蟲卵的檢測應(yīng)用中尚處于初步研究試驗中。研究表明對赤擬谷盜蟲卵有明顯染色效果的染色劑有溴甲酚綠、酸性品紅、橙黃 G[2]。本試驗利用溴甲酚綠、酸性品紅作為主要染色劑對小麥粉中幾種甲蟲的卵進(jìn)行了檢測，比較檢測的適用性、經(jīng)濟(jì)性和應(yīng)用范圍，試圖找到一種快速、準(zhǔn)確地判斷小麥粉中蟲卵的檢測方法，以便在我國的小麥粉加工業(yè)推廣應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器

生化培養(yǎng)箱SPX-250B型：上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠；數(shù)顯恒溫磁力攪拌器HJ-3：國華電器有限公司；雙目立體顯微鏡SZM45-B1：舜宇有限公司；高速冷凍離心機(jī)KDL-160HR：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；T6新世紀(jì)系列紫外可見光分光光度計：北京普析通用儀器有限公司。

1.2 試驗材料

一級高筋粉：鄭州金苑面業(yè)有限公司；石蠟油：上海生物工程股份有限公司；碘（粒狀）、碘化鉀、酸性品紅指示劑：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；溴甲酚綠指示劑：天津市瑞金特化學(xué)品有限公司

1.3 供試蟲卵

選取小麥粉中常見害蟲赤擬谷盜（Tribolium castaneum）作為蟲卵來源。赤擬谷盜蟲卵產(chǎn)生后帶有黏液，裏上小麥粉等碎屑后體積增大，能存留在100目谷物篩上。

小麥粉經(jīng)100目谷物篩過濾，以確保小麥粉干凈。挑選體表干凈、生命力強(qiáng)的赤擬谷盜，用過篩后小麥粉進(jìn)行飼養(yǎng)并在生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。經(jīng)過24 h進(jìn)行蟲卵采集。蟲卵暫存于培養(yǎng)皿中，待用。

1.4 檢測方法

1.4.1 浮選法

由于首次采用浮選法檢測小麥粉中的蟲卵，所用蟲卵數(shù)量較多，將 7、14、28、56、112粒蟲卵分別放入5 g小麥粉中，每種蟲卵3個重復(fù)，共15個樣品，將小麥粉樣品放在250 mL的燒杯中，加入90 mL 3%的鹽酸溶液攪拌形成懸濁液，將混合物放在干燥箱中在121℃下干燥5 min。將混合液通過100目的濾網(wǎng)過濾，用自來水沖洗后轉(zhuǎn)移到100 mL的燒杯中，加入7.5 mL的石蠟油，將混合液放在磁力攪拌器上高溫攪拌5 min，然后將混合液轉(zhuǎn)移到一個裝滿熱水的250 mL燒杯中，趁熱將溶液倒入250 mL分液漏斗中過濾，靜置30 min，在靜置的過程中間斷性搖晃。排除底層3 cm左右，重復(fù)排除底層操作2～3次直至底層的物質(zhì)被排除干凈。將分液漏斗中的溶液倒入250 mL燒杯中，量取3%的鹽酸溶液加到溶液中，然后將混合物放在磁力攪拌器上煮3～4 min。將混合液減壓抽真空過濾，將濾紙上的蟲卵轉(zhuǎn)移到凹盤中用雙目立體顯微鏡觀察并計算數(shù)量，檢測每5 g小麥粉中含有一定數(shù)量害蟲蟲卵的15個小麥粉試樣中存在的害蟲蟲卵的數(shù)量。

1.4.2 尿酸檢測法

FDA規(guī)定小麥粉蟲體碎片禁售水平為50 g小麥粉中75個昆蟲碎片，由于離心機(jī)及離心管規(guī)格所限，改進(jìn)為0.5 g小麥粉中加入 1、3、5、7、9、11粒蟲卵進(jìn)行試驗。分析天平稱取18個0.5 g的小麥粉樣品，然后按照改進(jìn)加入不同數(shù)量的害蟲蟲卵放在小麥粉試樣中，每個蟲卵數(shù)量3個重復(fù)，混勻。

在6只試管中各加入含有1、3、5、7、9、11粒蟲卵的0.5 g小麥粉，加入2 mL蒸餾水、1 mL 0.1%碳酸鈉溶液；震蕩，形成懸濁液。轉(zhuǎn)移至離心管中，于10 000 r／min離心10 min，得到上清液。取上層清液0.5 mL加入另一離心管中，再加入4.5 mL鎢酸試劑，混勻后靜置5 min，重復(fù)所有測試組。將第二輪離心管于3 000 r／min離心5 min。另外制作標(biāo)準(zhǔn)管與空白管，將上清液換成0.3 mmol／L尿酸標(biāo)準(zhǔn)液與蒸餾水。再取8只離心管，各移入第二輪中離心管2.5mL上清液，并加入0.5mL 100 g／L碳酸鈉溶液，混勻，室溫靜置10 min；加入0.5 mL磷鎢酸應(yīng)用液，混勻，置室溫20 min。20 min后，用紫外分光光度計測定其吸光度[12]。

通過比較吸光度，按經(jīng)驗公式確定尿酸濃度。

測定組尿酸濃度（μmol／L）＝（測定組吸光度／標(biāo)準(zhǔn)組吸光度）×300

1.4.3 幾丁質(zhì)檢測法

幾丁質(zhì)法首次應(yīng)用于小麥粉中蟲卵的檢測，供試蟲卵數(shù)量應(yīng)較多，自備7、14、28、56、112粒蟲卵，每種蟲卵數(shù)量3個重復(fù)，共15個樣品。

1.4.3.1 幾丁質(zhì)定性測定

消化管制備：取試管1支，配以橡皮塞，在橡皮塞上打1個直徑約為5 mm的孔。插上玻璃管，橡皮塞外端的玻璃管上再連接1根橡皮管，長30～50 cm，橡皮管的另一端再接1根一端拉細(xì)的開口的玻璃管，并將開口的玻璃管通入水槽內(nèi)，以防加熱時堿液濺出。取蟲卵適量，放入裝有8 mL飽和氫氧化鉀的試管中，塞緊帶有橡皮管的橡皮塞，置于甘油浴中加熱到160℃，保持15～20 min，由于蟲卵的大部分組織在高溫下被強(qiáng)堿消化，幾丁質(zhì)上乙?；幻撊?，得到透明薄膜狀的幾丁糖。

將各消化管內(nèi)未消化的物質(zhì)倒入小培養(yǎng)皿中，并用鑷子將其逐步移入95%、70%、50%、30%的酒精溶液中清洗，再用蒸餾水沖洗待用。

取一塊消化后的蟲卵（幾丁糖），置于白瓷點(diǎn)滴試驗板上，加一滴0.03%碘—碘化鉀溶液，再加一滴1%硫酸，幾丁糖立即產(chǎn)生紫褐色反應(yīng)。如再加上數(shù)滴75%硫酸稍待片刻，紫色變淡直至消失，表明幾丁糖已在濃硫酸作用下完全水解。

1.4.3.2 幾丁質(zhì)定量測定

分別選取正常產(chǎn)出的蟲卵，按設(shè)定取一定數(shù)量的蟲卵分別在分析天平上稱重。

將已知質(zhì)量的蟲卵分別放入消化管中，按1.4.3.1方法裝入消化管，再加入5 g小麥粉混勻，在氫氧化鉀飽和溶液中加熱消化。

將消化后剩余的幾丁糖薄膜細(xì)心地倒在濾紙上，用緩慢的流水沖洗干凈，然后用95%、100%酒精脫水稱重。

幾丁質(zhì)相對含量＝消化后蟲卵（mg）／消化前蟲卵（mg）×1.26×A×100%

轉(zhuǎn)換系數(shù)A＝乙酰胺基葡萄糖分子質(zhì)量／氨基葡萄糖分子質(zhì)量

1.4.4 染色法

FAO規(guī)定小麥粉蟲體碎片禁售水平為50 g小麥粉中含有小于或等于75個昆蟲碎片，若將這個標(biāo)準(zhǔn)用于蟲卵，按比例縮小，把 7、14、28、56、112粒蟲卵分別加入5 g小麥粉，混勻，每個蟲卵數(shù)量準(zhǔn)備3個重復(fù)，共15個樣品作為代檢驗樣品。將完全混合后的的小麥粉樣品用100＃篩網(wǎng)篩選并收集小麥粉殘留物與蟲卵，小麥粉顆粒包裹的蟲卵轉(zhuǎn)移到250 mL燒杯中，并用2～3 mL乙醇潤濕，然后加入5 mL稀硫酸（1∶19）后蓋上一培養(yǎng)皿，并保持10 min的蒸氣浴，產(chǎn)物通過布氏漏斗低壓抽濾。對于每一組，在無吸力的情況下加入10 mL染色劑（0.1%溴甲酚綠和0.05%酸性品紅）：2～3 min后，通過輕微的吸力將染色劑透過濾紙。后將濾紙轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，用雙目顯微鏡觀察，統(tǒng)計卵數(shù)。

1.4.5 4種檢測方法的驗證

為了確定檢測方法的準(zhǔn)確度，分別從鄭州金苑小麥粉廠和鄭州海嘉小麥粉廠隨機(jī)抽取了生產(chǎn)1周的特一粉和強(qiáng)筋小麥粉作為檢測樣品，在小麥粉袋的上、中、下部位進(jìn)行扦樣，每份60 g，均分成4份，每份再分成5 g的小份，每種方法3個重復(fù)，用浮選法、尿酸法、幾丁質(zhì)檢測法和染色法4種方法檢測小麥粉中有無蟲卵。同時把取樣的小麥粉放在人工培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1個月，利用篩網(wǎng)人工檢測小麥粉中幼蟲的數(shù)量作為實(shí)際蟲卵數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 浮選法檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性

浮選法檢測小麥粉中蟲卵的數(shù)量與理論放置的蟲卵的數(shù)量的相關(guān)性，如圖1所示。浮選法檢測小麥粉中蟲卵的最高檢測率僅為5.95%。

圖1 浮選法檢測蟲卵數(shù)量與理論放置蟲卵數(shù)的相關(guān)性分析

2.2 尿酸檢測法檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性

尿酸法檢測尿酸濃度與小麥粉中蟲卵數(shù)量的關(guān)系，如圖2所示。從圖2中可以看出，尿酸檢測法能檢測出小麥粉中不同蟲卵量的尿酸濃度，且成正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為R2＝0.998 6。

圖2 尿酸法檢測尿酸濃度與蟲卵數(shù)的相關(guān)性分析

2.3 幾丁質(zhì)檢測法檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性

2.3.1 幾丁質(zhì)定性

按照試驗方法進(jìn)行試驗，能夠觀察到圓點(diǎn)狀透明薄膜狀的幾丁糖漂浮在反應(yīng)溶液上（圖3）；按照試驗方法進(jìn)行幾丁糖顯色反應(yīng)，可以明顯觀察到紫色絮狀物生成（圖4），可以認(rèn)定蟲卵中含有一定量的幾丁質(zhì)。

圖3 透明薄膜狀幾丁糖

圖4 幾丁糖顯色反應(yīng)

2.3.2 幾丁質(zhì)定量

反應(yīng)物于強(qiáng)堿環(huán)境中高溫加熱反應(yīng)，生成橘紅色黏稠物質(zhì)，沒有發(fā)現(xiàn)圓點(diǎn)狀幾丁糖薄膜；取生成物進(jìn)行幾丁糖顯色反應(yīng)，無紫色生成，說明幾丁質(zhì)被消化完。此方法不能進(jìn)行定量試驗，有待進(jìn)一步探討。

2.4 染色法檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性

采用不同染料的染色結(jié)果有顯著的區(qū)別，溴甲酚綠將蟲卵染成黃橙色（圖5），小麥粉染成褐綠色；酸性品紅將蟲卵與小麥粉染成紫色，蟲卵外觀近似透明，小麥粉相對顏色更深（圖6）。

圖5 利用溴甲酚綠染色劑對小麥粉中蟲卵染色的效果

圖6 利用酸性品紅染色劑對小麥粉中蟲卵染色的效果

不同的染料的顏色結(jié)果與理論蟲卵數(shù)有一定的相關(guān)性，如圖7所示。從圖7中可知溴甲酚綠染色結(jié)果檢測到的蟲卵數(shù)與理論蟲卵數(shù)的相關(guān)性回歸方程為y＝0.86x-1.791 3相關(guān)系數(shù)R2＝0.999 6；酸性品紅染色結(jié)果檢測發(fā)現(xiàn)的蟲卵數(shù)與實(shí)際蟲卵數(shù)相關(guān)回歸方程 y＝0.825 3x-3.615 8，相關(guān)系數(shù) R2＝0.997 9。

圖7 不同染色劑對小麥粉中蟲卵染色結(jié)果與理論蟲卵量的相關(guān)性分析

2.5 4種檢測小麥粉中蟲卵方法的比較

4種檢測方法各有利弊，為了便于進(jìn)一步研究，把不同方法的經(jīng)濟(jì)性、適用性和實(shí)用性等方面進(jìn)行了比較分析，結(jié)果如表1所示。從表1可以看出，浮選法僅僅適用于昆蟲碎片的檢測，而不適合檢測小麥粉中的卵。尿酸的檢測方法成本較低，結(jié)果較為準(zhǔn)確，可以應(yīng)用于蟲卵的分析。

表1 小麥粉中幾種蟲卵檢測方法的比較

2.6 4種檢測方法檢測小麥粉中蟲卵結(jié)果的比較

利用4種檢測方法對2種不同生產(chǎn)廠家的小麥粉進(jìn)行檢測，并比較蟲害培養(yǎng)1個月后的結(jié)果，如表2所示。從表2可以看出，4種檢測方法中幾種尿酸檢測方法和染色法對小麥粉樣品可以檢測出來蟲卵的含量，與1個月的培養(yǎng)結(jié)果相比，檢出率分別達(dá)到73.3%和85%，說明尿酸檢測方法和染色法可以初步用于小麥粉中蟲卵的檢測。

表2 4種檢測方法檢測隨機(jī)小麥粉中蟲卵的結(jié)果比較

3 討論

研究了用于檢測小麥粉中卵幾種方法，其中染色法和浮選法（FAO）雖然有過相關(guān)的研究[2-4]，但本研究采用了不同的染色劑進(jìn)行染色，并把用于檢測害蟲碎片的浮選法用于蟲卵的檢測。另外試驗首次探索了利用害蟲的排泄物尿酸的尿酸檢測法和幾丁質(zhì)（昆蟲體壁的特殊結(jié)構(gòu)）檢測方法進(jìn)行小麥粉中卵的檢測的方法。

結(jié)果表明，浮選法在檢測小麥粉中的卵時，檢測效果比較低（不到10%），且沒有明顯的規(guī)律。FAO規(guī)定的小麥粉中昆蟲碎片的檢測可以用浮選法進(jìn)行，但根據(jù)本試驗結(jié)果分析，并不適用于小麥粉中蟲卵的檢測。影響或誤差原因可能包括：蟲卵在3%鹽酸中、經(jīng)干燥箱121℃干燥加熱5 min以及高溫水浴都有可能造成蟲卵解體或溶解，造成試驗結(jié)果偏低；蟲卵經(jīng)篩網(wǎng)篩選過程中，可能夾藏在網(wǎng)眼或縫隙中，造成試驗結(jié)果偏低；蟲卵、水、石蠟油混合液在分液過程中可見蟲卵因石蠟油粘在分液漏斗壁上，造成試驗結(jié)果偏低。適用于昆蟲碎片的檢測方法，用于蟲卵檢測可能導(dǎo)致蟲卵破碎，從而導(dǎo)致試驗結(jié)果較低。

尿酸檢測法中檢測到蟲卵尿酸的濃度隨蟲卵數(shù)增多而上升，成正相關(guān)。但增幅并不一致，造成該結(jié)果的原因可能包括：蟲卵大小不一，尿酸含量可能不同；檢測量較小，細(xì)微的小麥粉質(zhì)量差別或試劑劑量差別可能導(dǎo)致最終結(jié)果出現(xiàn)誤差。從驗證的結(jié)果看該方法還需要進(jìn)一步的改進(jìn)。幾丁質(zhì)檢測方法通過檢測幾丁糖從而確定蟲卵所含幾丁質(zhì)的量，這種試驗方法需要進(jìn)一步研究，目前不宜用于小麥粉中蟲卵的檢測。

染色方法中2種染色劑的染色效果接近，但都存在一定的誤差。染色法可將小麥粉和蟲卵染成不同的顏色，便于對比統(tǒng)計。但因為需要經(jīng)過篩網(wǎng)過濾，對于蟲卵直徑有較高要求；對于已知害蟲種類的蟲卵，可以精確篩網(wǎng)尺寸，但對于不明確害蟲種類的蟲卵，篩網(wǎng)尺寸難以確定，進(jìn)而導(dǎo)致檢測過程困難或檢測結(jié)果有較大偏差。染色法可以用于小麥粉中常見蟲卵檢測，但難以普及至全部害蟲蟲卵的檢測。

4 結(jié)論

浮選法可導(dǎo)致蟲卵破損和遺失，造成試驗結(jié)果顯著偏低，即浮選法不適用于蟲卵的檢測。

幾丁質(zhì)檢測法只能對蟲卵含有的幾丁質(zhì)定性，但不能定量，所以此法不易用于小麥粉中蟲卵的檢測，需要進(jìn)一步研究；尿酸檢測法表明蟲卵尿酸濃度與蟲卵數(shù)成正相關(guān)，最低限能檢測到1 kg小麥粉中含有100粒蟲卵，尿酸檢測法可初步應(yīng)用于小麥粉中蟲卵的檢測，但需要進(jìn)一步研究；溴甲酚綠和酸性品紅染色劑可以將蟲卵與小麥粉染成不同的顏色，染色法可以初步用于小麥粉中常見害蟲蟲卵的檢測，但需要進(jìn)一步找到染色效果更加合適的染色劑。

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