基于高光譜成像技術(shù)和因子判別分析的玉米黃曲霉毒素檢測研究

袁 瑩 王 偉 褚 璇 P.Feldner G.Heitschmidt

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院1，北京 100083）

（Quality&Safety Assessment Research Unit，USDA-ARS2，Athens 30605）

黃曲霉毒素是黃曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）的代謝產(chǎn)物[1]，具有極強(qiáng)的毒性，1993年被世界衛(wèi)生組織癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為Ⅰ類致癌物[2]，它主要有 B1、B2、G1、G2、M1和 M2等類型，其中以B1毒性最大。黃曲霉毒素主要污染糧油食品、動植物食品等，如花生、玉米、大米、小麥、豆類、堅(jiān)果類、肉類等，其中以玉米和花生污染最為嚴(yán)重。玉米作為我國主要的經(jīng)濟(jì)型糧食作物，但因霉變造成的產(chǎn)后損失巨大，不僅如此，食用了感染黃曲霉毒素的玉米，將會直接危及人、畜生命和健康，因此對黃曲霉毒素的及時檢出就顯得尤為重要。

目前，黃曲霉毒素的檢測方法主要包括薄層層析法（TLC）、高效液相色譜法（HPLC）、免疫分析法（ELISA）等[3-6]，然而這些檢測方法普遍存在檢測時間長、檢測結(jié)果慢、不適于在線應(yīng)用、經(jīng)濟(jì)性差等缺點(diǎn)[7]。高光譜成像技術(shù)是融合圖像技術(shù)和光譜技術(shù)而成的一門新技術(shù)[8]。所謂高光譜成像技術(shù)，即在紫外到近紅外（200～2 500 nm）的光譜范圍內(nèi)，利用成像光譜儀，在光譜覆蓋范圍內(nèi)的幾十到數(shù)百個光譜波段對目標(biāo)物體連續(xù)成像，在獲得物體空間特征成像的同時，也獲得被測物體的光譜信息，在可見光到近紅外波段，其光譜分辨率可達(dá)納米級[9]。高光譜成像技術(shù)結(jié)合光譜與計(jì)算機(jī)圖像技術(shù)兩者的優(yōu)點(diǎn)，可獲得大量可包含連續(xù)波長光譜信息的圖像塊，圖像信息可用于檢測表面，而光譜信息可用于檢測內(nèi)部成分、品質(zhì)。與傳統(tǒng)的近紅外光譜分析技術(shù)和可見光圖像技術(shù)相比，分別具有像素級檢測能力，可同時獲取樣品物理和內(nèi)部化學(xué)成分信息等優(yōu)點(diǎn)[10]。因而高光譜成像技術(shù)在果蔬表面品質(zhì)[11]、內(nèi)部品質(zhì)[12]、禽類肉質(zhì)品質(zhì)[13]以及對水果糖度等指標(biāo)的定量分析[14-16]均得到了廣泛應(yīng)用。本試驗(yàn)采用高光譜成像技術(shù)對玉米籽粒表面的黃曲霉毒素B1進(jìn)行檢測。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)采用的樣品為先鋒玉米籽粒，選取了150粒尺寸和外觀大致相同的于2010年夏季收獲的同種玉米籽粒。樣品由美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究署真菌毒素研究所提供。

1.2 樣品準(zhǔn)備

為了排除玉米樣品中天然自帶的霉菌對光譜數(shù)據(jù)的干擾，先將試驗(yàn)用的玉米籽粒放入盛有20%甲醇溶液的燒杯中浸泡，然后放置在濾紙上進(jìn)行干燥，以殺死殘余的霉菌孢子。將500μg／L的黃曲霉毒素原液用甲醇稀釋，配制成4種不同質(zhì)量濃度的黃曲霉毒素溶液，濃度依次為10、20、100、500μg／L。

將150個樣品平均分為5組，保證每粒玉米樣品的胚芽朝上，方向一致放置在聚四氟乙烯板上對應(yīng)的凹槽處，每塊聚四氟乙烯板的表面被設(shè)計(jì)成分布30個淺橢圓形的小坑，用以擺放30個玉米樣品。預(yù)留一組30粒玉米作為對照樣品組，不再進(jìn)行任何處理；然后分別用移液管在其余4組每組30粒玉米顆粒表面中心位置處滴上之前所配制的4種不同濃度的黃曲霉毒素溶液。

1.3 高光譜成像系統(tǒng)

利用搭建在美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究所的可見／近紅外高光譜成像系統(tǒng)進(jìn)行光譜采集。該高光譜成像系統(tǒng)是由4.5mmPCO.EDGE高靈敏度相機(jī)（Romulus，MI，U.S.A.），光譜儀（Specim V10M spectrograph Oulu，F(xiàn)inland），蔡司 Distagon T 25 mm f／2.8鏡頭（Oberkochen，Germany）和2個500W的鹵鎢燈（Watsonville，CA，U.S.A.）組成。該高光譜系統(tǒng)可以采集400～1 000 nm范圍的反射光譜，采集光譜的數(shù)據(jù)點(diǎn)為835個。

1.4 光譜信息的提取

對于每張圖像，都是將玉米籽粒上感染黃曲霉毒素的可見的干燥、白色點(diǎn)作為感興趣區(qū)域（Regions of Interest，ROI’s）。針對每個樣品，在集中分布黃曲霉毒素的地方取最小50個像素為ROI’s，這50個像素應(yīng)選擇在被污染點(diǎn)的中心，大小應(yīng)小于被污染面積，避免包含邊緣部分，以防止光譜采集時采集到污染物以外信息的光譜數(shù)據(jù)。每個ROI的平均反射率被計(jì)算并轉(zhuǎn)化為log（1／反射率）以表示吸收率。圖1為轉(zhuǎn)換后的每組30粒玉米顆粒的平均近紅外吸收光譜。

圖1 樣品的平均吸收光譜

1.5 光譜數(shù)據(jù)的預(yù)處理

為了消除由于樣品形狀不同及表面凹凸不平產(chǎn)生的散射對光譜的影響[17]，需要用適當(dāng)?shù)墓庾V預(yù)處理方法來消除背景噪聲及特定的物理因素的干擾，提高譜圖與化學(xué)成分之間的相關(guān)性。采用標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量校正處理，在Matlab2012a軟件中進(jìn)行預(yù)處理。預(yù)處理后所得的光譜曲線如圖2所示。

圖2 預(yù)處理后的樣品光譜

2 結(jié)果與分析

2.1 主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）

由于試驗(yàn)中每個樣品有835個原始光譜數(shù)據(jù)點(diǎn)，各個光譜數(shù)據(jù)都在不同程度上反映了某些信息，且各個數(shù)據(jù)之間彼此又有一定的相關(guān)性，因而所得的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)反映的信息在一定程度上有重疊。在進(jìn)行數(shù)據(jù)處理時，數(shù)據(jù)量太多、數(shù)據(jù)存在多重共線性會增加計(jì)算量和分析問題的復(fù)雜性。為了解決這一問題，試驗(yàn)采用PCA進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。PCA[18-19]是多元統(tǒng)計(jì)中的一種方法，利用它可以對樣品光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行降維，并從多重因素中解析出主要影響因素[20]。分析結(jié)果如圖3所示。

圖3 基于PCA的前3個主成分的樣本分布

圖3中x軸表示樣品第一主成分得分（A1），y軸表示樣品第二主成分得分（A2），z軸表示樣品第三主成分得分（A3），從圖3中可看出0μg／L的樣品組呈現(xiàn)較為明顯的聚類現(xiàn)象，但各組樣品無法進(jìn)行明顯的區(qū)分。為了進(jìn)行正確的區(qū)分檢測，采用因子判別分析（Factorial Discriminant Analysis，F(xiàn)DA）建立試驗(yàn)5組樣品的檢測分析模型。

經(jīng)主成分分析光譜數(shù)據(jù)后得到前14個主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率如表1所示，前14個主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率已經(jīng)達(dá)到了99.8%，幾乎可以表征原始光譜的全部信息。

表1 前14個主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率

2.2 因子判別FDA分類分析

因子判別FDA是一種監(jiān)督辨別分類技術(shù)，F(xiàn)DA旨在通過最大化類間方差找到原始變量空間中最好分開各類的子空間，其優(yōu)點(diǎn)在于是一個可以逐步回歸尋找特征變量的簡單線性非參數(shù)分類器[21]。因此，試驗(yàn)采用FDA對樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行辨別分類。

將150個樣品數(shù)據(jù)，利用Matlab2012a隨機(jī)選取100個樣品作為訓(xùn)練集，其余的50個樣品作為驗(yàn)證集，隨機(jī)選取的結(jié)果如表2所示，可見所選取的各類數(shù)量大致相同。

表2 樣品選取結(jié)果

利用FDA函數(shù)，將前14個主成分作為輸入，所建立FDA判別函數(shù)F1、F2、F3和F4分別如公式（1）-（4）所示：

進(jìn)而將訓(xùn)練集和驗(yàn)證集的前14個主成分?jǐn)?shù)據(jù)作為輸入分別進(jìn)行分類結(jié)果驗(yàn)證，得到的判別結(jié)果混淆矩陣及正確率如表3、表4所示。

表3 訓(xùn)練集的判別結(jié)果及正確率

表4 驗(yàn)證集的判別結(jié)果及正確率

判別結(jié)果顯示，訓(xùn)練集的判別正確率達(dá)到95%。驗(yàn)證集的50個樣品中，除了有1個500μg／L的樣品被錯判為100μg／L，6個100μg／L的樣品被錯判為500μg／L外，其余的43個樣品均判別正確，正確率達(dá)到86%。這是由于100μg／L和500μg／L的黃曲霉毒素都屬于高質(zhì)量濃度，在數(shù)據(jù)上存在著一定的近似，所以會出現(xiàn)錯判。判別結(jié)果證實(shí)了將樣品的前14個主成分作為輸入，利用FDA的方法進(jìn)行玉米表面不同黃曲霉毒素濃度的識別是可行的。

3 結(jié)論

對滴有不同濃度黃曲霉毒素的玉米籽粒進(jìn)行波長范圍為400～1 000 nm可見／近紅外高光譜數(shù)據(jù)獲取，對光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)降維后，以所獲得的前14個主成分作為輸入，利用因子判別分析建立分類判別模型，實(shí)現(xiàn)了包含對照樣品在內(nèi)的5類玉米表面含有不同黃曲霉毒素濃度的準(zhǔn)確識別，訓(xùn)練集和驗(yàn)證集的識別準(zhǔn)確率分別達(dá)到了95%和86%。表明利用高光譜成像技術(shù)，將主成分分析和因子判別分析相結(jié)合，進(jìn)行玉米表面不同黃曲霉毒素濃度的識別是可行的。

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