痔瘡膠囊微生物限度檢查法驗證研究

笪寧虞

摘要：建立痔瘡膠囊微生物限度檢查法。關鍵詞：痔瘡膠囊；微生物限度檢查；方法驗證【中圖分類號】R965【文獻標識碼】B【文章編號】1672-8602(2014)04-0120-01痔瘡膠囊具有清熱解毒，涼血止痛，祛風消腫的功效。用于痔瘡，肛裂，大便秘結等癥。含有大黃等中藥成分。根據其制劑用藥途徑和制法，應進行細菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)、大腸埃希菌檢查。經實驗研究，確定采用常規(guī)法進行細菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)、大腸埃希菌檢查。經對所確定的方法進行驗證，符合《中國藥典》2010年版一部附錄XIIIC有關微生物限度檢查法有關規(guī)定，方法可行。1實驗儀器、試藥 1.1實驗菌種:枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉。1.2樣品：痔瘡膠囊（批號：120301、120402、120603）；生產：廣西錦瑩藥業(yè)有限公司。1.3培養(yǎng)基及稀釋劑:營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，BL培養(yǎng)基等。1.4儀器:培養(yǎng)箱、生物安全柜等。2細菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)檢驗方法的建立及驗證 2.1菌液制備:取經35℃培養(yǎng)18～24h的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制備成每1ml含菌數(shù)為50～100cfu的菌懸液，備用；取經25℃培養(yǎng)24～48h的白色念珠菌液體培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制備成每1ml含菌數(shù)為50～100cfu的菌懸液,備用；取經25℃培養(yǎng)1周的黑曲霉斜面培養(yǎng)物，加10 ml 0.9%無菌氯化鈉溶液洗下霉菌孢子，吸取菌液用0.9%無菌氯化鈉溶液制備成每1ml含菌數(shù)為50～100cfu的菌懸液，備用。2.2供試液的制備方法: 常規(guī)法：取樣品10g，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成1：10的供試液；取1：10的供試液1ml注皿。2.3回收率試驗:試驗組：同2.2，另分別取各試驗菌50～100CFU，分別注入同一平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置規(guī)定溫度，細菌培養(yǎng)24～48h，白色念珠菌和黑曲霉培養(yǎng)48～72h。菌液組：取試驗菌50～100CFU注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置規(guī)定溫度，細菌培養(yǎng)24～48h，白色念珠菌和黑曲霉培養(yǎng)48～72h，測定所加入的試驗菌數(shù)，平行制備2個平皿。供試品對照組：同2.2，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置規(guī)定溫度，細菌培養(yǎng)24～48h，霉菌和酵母菌培養(yǎng)48～72h，測定供試品本底菌數(shù)。2.4方法的確定:選用金黃色葡萄球菌、白色念珠菌作為敏感菌株進行預試驗，結果見表1：表1敏感菌株常規(guī)法預試驗結果 菌種 金黃色葡萄球菌（CFU/平皿） 白色念珠菌（CFU/平皿）計數(shù) 平皿 平均值平皿 平均值試驗組 95 96 96 89 85 87供試品對照組 0 0 0 0 0 0菌液組 101 95 95 97 92 87 95 91回收率（%） 99 96結果：金黃色葡萄球菌回收率為99%，大于70%；白色念珠菌回收率為96%，大于70%，表明痔瘡膠囊對細菌、真菌無抑制作用，采用常規(guī)法進行細菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)測定可行。2.5細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法驗證取3個批號痔瘡膠囊樣品，細菌數(shù)、霉菌及酵母菌數(shù)按常規(guī)法進行加菌回收率試驗，結果見表2、3、4：表2批號為120301的痔瘡膠囊回收率試驗結果菌種回收率大腸埃希菌枯草芽孢桿菌 金黃的葡萄球菌 白色念珠菌 黑曲霉計數(shù)平皿 平均值平皿 平均值 平皿 平均值 平皿 平均值 平皿 平均值試驗組118 125 121 98 87 92 111 125 118 149 179 164 119 123 121供試品對照組0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0回收率（%）110 111 83 149 89表3批號為120402的痔瘡膠囊回收率試驗結果 菌種回收率大腸埃希菌枯草芽孢桿菌 金黃的葡萄球菌 白色念珠菌 黑曲霉計數(shù)平皿 平均值平皿 平均值 平皿 平均值 平皿 平均值 平皿 平均值試驗組96 133 114 80 102 91 129 136 132 145 152 148 125 108 116供試品對照組0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0回收率（%）104 110 92 135 85表4批號為120603的痔瘡膠囊回收率試驗結果 菌種回收率大腸埃希菌枯草芽孢桿菌 金黃的葡萄球菌 白色念珠菌 黑曲霉計數(shù)平皿 平均值平皿 平均值 平皿 平均值 平皿 平均值 平皿 平均值試驗組103 112 107 92 80 86 125 123 124 158 144 151 109 126 117供試品對照組0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0回收率（%）97 104 87 137 86三個批號樣品的驗證試驗結果表明，以常規(guī)法進行痔瘡膠囊細菌數(shù)、霉菌及酵母菌數(shù)測定，五種規(guī)定試驗菌的回收率均大于70%，符合《中國藥典》2010年版的規(guī)定，方法可行。3控制菌檢驗方法的建立及驗證 菌液制備同2.1。3.1大腸埃希菌： 常規(guī)法：試驗組：取1：10供試液10ml接種至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基，同時加入大腸埃希菌10～100CFU，35℃培養(yǎng)24～48h。取培養(yǎng)物0.2ml接種至含5ml MUG培養(yǎng)基的試管中，35℃培養(yǎng)24h左右，366nm紫外燈下觀察熒光，然后進行靛基質試驗，觀察結果；另取培養(yǎng)物劃線接種于曙紅亞甲藍（EMB）平板，35℃培養(yǎng)18～24h，觀察其菌落形態(tài)。陰性菌對照組：取金黃色葡萄球菌作為陰性對照試驗菌，方法同試驗組。3.2試驗結果： 大腸埃希菌：常規(guī)法試驗結果：試驗組與陰性對照組相比較有明顯的變化，實驗組有明顯產酸產氣現(xiàn)象，結果如表5: 表5大腸埃希菌檢查常規(guī)法試驗結果大腸埃希菌 試驗組 陰性菌對照組BL + -MUG，靛基質 +，+ -，-EMB平板 + -4結語 根據上述實驗結果，擬定痔瘡膠囊微生物限度檢查法標準正文如下：微生物限度取本品10g，用pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液制成1：10的供試液。細菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)、大腸埃希菌：取1：10的供試液，采用常規(guī)法，依法檢查，應符合規(guī)定。細菌數(shù)每1g不得過1000cfu，霉菌和酵母菌數(shù)每1g不得過100cfu，大腸埃希菌每1g不得檢出。5三批痔瘡膠囊的微生物限度檢查 按上述所建立的痔瘡膠囊微生物限度檢查法，對三批樣品進行檢驗，結果見表6表6三批痔瘡膠囊微生物限度檢查結果批號 細菌數(shù) 霉菌、酵母菌數(shù) 大腸埃希菌 結論120301 小于10個/g 小于10個/g 未檢出 符合規(guī)定120402 小于10個/g 小于10個/g 未檢出 符合規(guī)定120603 小于10個/g 小于10個/g 未檢出 符合規(guī)定參考文獻[1]2010年版《中國藥典》一部(上接第119頁)3討論 舒張性心力衰竭主要與心室充盈功能障礙等有關，由于左心室射血過程中承受壓力最大，造成心室充盈損傷更嚴重，加上患者伴有高血壓疾病，長期高血壓控制不力，導致患者交感神經異常興奮，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)功能紊亂，水鈉代謝異常，加重肺淤血癥狀[5]。相關研究表明舒張性心力衰竭與高血壓及年齡密切相關，對于老年高血壓伴發(fā)舒張性心力衰竭患者來說，高血壓進一步加重舒張功能損傷及心室充盈損傷，且血壓不間斷上升加重心臟負荷，可能演變?yōu)槌溲孕牧λソ?，最終威脅患者性命。相關研究及臨床實踐表明螺內酯治療老年高血壓伴舒張性心力衰竭效果明顯，這與螺內酯內在機制有關，該藥物屬于一種特異性醛固酮拮抗劑，不僅可以利尿、保鉀及鎂元素，而且還可以增強心臟攝取去甲腎上腺素能力，維持心率平穩(wěn)，緩解患者心肌纖維變性及心律失常等癥狀，在心力衰竭、高血壓患者中得到廣泛的應用。6分鐘步行測驗作為臨床上一種操作簡單的測定方法，主要是評價老年心力衰竭患者心臟功能及運動耐受力，本研究中實驗組患者經螺內酯治療后6分鐘步行距離明顯長與對照組，t值為4.755，差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.05。可見螺內酯可以更有效的改善患者心功能，提高患者運動耐受力。同時治療中用超聲心動圖檢查患者左心室功能，由于心動圖可以全面、連續(xù)、多方位的對患者心臟監(jiān)測，且能深入剖析心臟構造，為此監(jiān)測結果更準確，為患者早期治療提供重要依據。實驗組患者治療后超聲心動圖觀測到E峰值、A峰值、E/A值明顯優(yōu)于對照組，可見螺內酯可明顯改善患者心室舒張功能。另外，治療過程中對所有患者的血漿腦鈉肽及膠原氨基端肽等指標進行測定，這是因為血漿腦鈉肽源自心室肌細胞，能有效擴張血管，抑制交感神經系統(tǒng)興奮，效果與螺內酯類似，可將其作為心力衰竭嚴重程度的判斷標志。而膠原氨基端肽可以有效反映心肌纖維化程度。本研究中實驗組患者治療后血漿腦鈉肽及膠原氨基端肽下降明顯優(yōu)于對照組，P＜0.05。綜上所述，螺內酯能明顯改善高血壓合并舒張性心力衰竭老年患者心功能，提高其運動耐力，可深入研究利用。參考文獻[1]劉德惠.螺內酯治療老年高血壓并發(fā)舒張性心力衰竭療效分析[J].中國藥物經濟學,2013（06）:54-56. [2]朱志輝,孫維龍.螺內酯治療老年高血壓并發(fā)舒張性心力衰竭的療效分析[J].北方藥學,2013（09）:20-21. [3]劉海軍,籍振國.螺內酯對老年高血壓并發(fā)舒張性心力衰竭的療效觀察[J].疑難病雜志,2010（09）:674-675. [4]Borlaug BA，Lam CS，Roger VL，et al. Contractility and ventricular systolic stiffening in hypertensive heart disease insights into the pathogenesis of heart failure with preserved ejectionfraction [J]. J Am Coll Cardiol，2009（5）：410-418.[5]BadleM,RolgE,peerz-Villa F，et al.Incerased expression of the renin-angiotensin system and mast cell density but not of angiotensin-converting enzyme II in late satges of human heart failure [J].2006 (9):1117-1125.