TWEAK和Fn14在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病中的作用

舒如明++++++何潔

[摘要]目的 探討腫瘤壞死因子樣凋亡弱誘導(dǎo)劑（TWEAK）和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)型14（Fn14）在子宮內(nèi)膜異位癥（EMs）中的表達(dá)與功能。方法 選取2014年6月～2015年6月我院婦產(chǎn)科收治的50例EMs患者作為研究對(duì)象，其中30例為異位囊壁組，20例為在位內(nèi)膜組，同時(shí)收集與研究組匹配的因子宮肌瘤、宮頸病變等疾病接受全子宮切除術(shù)的20例患者作為對(duì)照組。利用免疫組織化學(xué)、Western-Blot及RT-PCR檢測(cè)TWEAK、Fn14在不同組的基因和蛋白表達(dá)，根據(jù)所得數(shù)據(jù)分析TWEAK、Fn14表達(dá)水平與CA-125水平、抗子宮內(nèi)膜抗體（EMAb）、修正子宮內(nèi)膜異位癥分期（r-AFS）的相關(guān)性。結(jié)果 三組患者的TWEAK、Fn14陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；異位囊壁組、在位內(nèi)膜組患者的TWEAK、Fn14陽性表達(dá)率均明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；EMs患者TWEAK、Fn14陽性表達(dá)率在r-AFS、CA-125、EMAb中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；TWEAK、Fn14表達(dá)水平與r-AFS、CA-125、EMAb均成正相關(guān)（P<0.05）。結(jié)論 TWEAK/Fn14參與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生和發(fā)展，TWEAK/Fn14水平異常可導(dǎo)致子宮內(nèi)膜細(xì)胞的凋亡水平下降。

[關(guān)鍵詞]子宮內(nèi)膜異位癥；TWEAK；Fn14；免疫組織化學(xué)

[中圖分類號(hào)] R730.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2017）10（b）-0065-04

[Abstract]Objective To investigate the expression and function of tumor necrosis factor like apoptosis inducer （TWEAK） and fibroblast growth factor inducible 14 （Fn14） in endometriosis （EMs）.Methods 50 EMs patients in department of obstetrics and gynecology of our hospital from June 2014 to June 2015 were selected as the subjects.Among them，30 cases were ectopic cyst wall group，20 cases were eutopic endometrium group.At the same time，20 patients who received hysterectomy in the study group matched with the diseases of uterine fibroids and cervical lesions were collected as the control group.Gene and protein expression in different groups by immunohistochemistry，Western-Blot and RT-PCR detection of TWEAK，F(xiàn)n14，according to the data analysis of TWEAK，F(xiàn)n14 expression level and CA-125 level，anti endometrial antibody （EMAb），modified endometriosis stage （r-AFS） correlation analysis.Results The positive rates of TWEAK and Fn14 were significantly different between the three groups，the differences were statistically significant （P<0.05）.The positive rates of TWEAK and Fn14 in ectopic cyst wall group and eutopic endometrium group were significantly higher than those in the control group，the differences were statistically significant （P<0.05）.The positive rates of TWEAK and Fn14 in patients with EMs were significantly different in r-AFS，CA-125 and EMAb，and the differences were statistically significant （P<0.05）.According to the correlation analysis，the expression levels of TWEAK and Fn14 were positively correlated with r-AFS，CA-125 and EMAb （P<0.05）.Conclusion TWEAK/Fn14 is involved in the occurrence and development of endometriosis.Abnormal levels of TWEAK/Fn14 can lead to decreased apoptosis of endometrial cells.

[Key words]Endometriosis；TWEAK；Fn14；Immunohistochemistry

具有生長(zhǎng)功能的子宮內(nèi)膜組織出現(xiàn)在子宮內(nèi)膜以外部位時(shí)稱為子宮內(nèi)膜異位癥（EMs）[1]。EMs是一種激素依賴性疾病，可表現(xiàn)出盆腔疼痛和（或）不孕癥等臨床癥狀[2]。有資料顯示腫瘤壞死因子樣凋亡弱誘導(dǎo)劑（TWEAK）及受體成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)分子14（Fn14）在多種腫瘤細(xì)胞與組織中的表達(dá)，具有廣泛的生物學(xué)活性，在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖和血管形成，提高細(xì)胞侵襲力，誘導(dǎo)炎癥因子表達(dá)等方面發(fā)揮作用，參與疾病的發(fā)生與發(fā)展，嚴(yán)重影響患者預(yù)后情況[3]。因此，本研究利用免疫組織化學(xué)、Western-Blot及RT-PCR檢測(cè)TWEAK、Fn14在不同組的基因和蛋白表達(dá)水平，結(jié)合CA-125水平、抗子宮內(nèi)膜抗體（EMAb）、修正子宮內(nèi)膜異位癥分期（r-AFS）等數(shù)據(jù)，探討TWEAK/Fn14在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)與功能，具體報(bào)道如下。endprint

1資料與方法

1.1一般資料

選取2014年6月～2015年6月本院婦科收治的50例EMs患者作為研究組，同時(shí)選取與研究組匹配的因子宮肌瘤、宮頸病變等疾病接受全子宮切除術(shù)的20例患者作為對(duì)照組。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核，內(nèi)膜提供者均對(duì)本次研究知情并簽署同意書。研究組納入標(biāo)準(zhǔn)：均在我院婦產(chǎn)科醫(yī)院行腹腔鏡或手術(shù)治療，術(shù)中所見及術(shù)后病理均證實(shí)為EMs患者；一般資料及臨床資料完整者。研究組排除標(biāo)準(zhǔn)：失防患者；術(shù)前3個(gè)月內(nèi)未接受激素治療的患者；嚴(yán)重意識(shí)障礙，無法配合調(diào)查者；合并內(nèi)分泌、免疫性、代謝性等其他疾病。年齡20～50歲，平均年齡（35.49±7.24）歲；月經(jīng)規(guī)律，周期26～35 d，平均周期（29.49±3.24）d；30例異位囊壁組，20例在位內(nèi)膜組（10例增生期內(nèi)膜，10例分泌期內(nèi)膜）；根據(jù)修正子宮內(nèi)膜異位癥分期：Ⅰ期7例，Ⅱ期13例，Ⅲ期19例，Ⅳ期11例。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：子宮肌瘤、宮頸病變等疾病接受全子宮切除術(shù)的患者；子宮內(nèi)膜正常；對(duì)照組排除標(biāo)準(zhǔn)：EMs患者。年齡20～52歲，平均年齡（36.59±7.34）歲；月經(jīng)規(guī)律，周期26～35 d，平均周期（28.49±5.24）d。異位囊壁組、在位內(nèi)膜組及對(duì)照組三組患者的一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2檢測(cè)方法

所有患者均在術(shù)中刮取內(nèi)膜，用剪刀剪下小塊異位囊腫囊壁，部分置入液氮中凍存，部分用10%的甲醛固定，石蠟包埋，待用。用細(xì)胞定位（細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)）、強(qiáng)度及分布評(píng)估免疫組化染色結(jié)果。TWEAK和Fn14水平和蛋白表達(dá)利用免疫組織化學(xué)檢測(cè)[4-5]，兔抗人多克隆TWEAK抗體及羊抗人Fn14多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，PV9000免疫組化試劑盒、Ⅱ抗及DAB顯色購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)開發(fā)公司，所有實(shí)驗(yàn)操作步驟嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。統(tǒng)計(jì)三組患者的陽性率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果由兩位病理科醫(yī)師獨(dú)立進(jìn)行觀察判斷。三組患者均在未經(jīng)過任何治療前采集靜脈血并分離血清，將血標(biāo)本立即離心10 min，去上清，檢測(cè)CA-125水平，試劑由羅氏公司提供，產(chǎn)地上海；檢測(cè)機(jī)器采用SIEMENS生產(chǎn)的APVIA Centaur CP機(jī)器，操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。血清CA-125≥35 U/mL為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.3觀察指標(biāo)

觀察TWEAK以及Fn14在三組患者中的表達(dá)水平及與CA-125水平、EMAb、r-AFS的臨床相關(guān)性。r-AFS分期標(biāo)準(zhǔn)：按病變累及部位、大小以及粘連程度打分，對(duì)卵巢、腹膜、卵管的病灶和粘連分別加權(quán)評(píng)分，1～5分為Ⅰ期，6～15分Ⅱ期，16～30分為Ⅲ期，≥31分為Ⅳ期。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Spersman進(jìn)行相關(guān)性分析，r>0成正相關(guān)，r<0成負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值愈接近1，相關(guān)性愈密切。

2結(jié)果

2.1三組患者TWEAK、Fn14表達(dá)的比較

50例EMs患者中TWEAK陽性41例，陽性表達(dá)率為82.00%，F(xiàn)n14陽性40例，陽性表達(dá)率為80.00%。三組患者的TWEAK、Fn14陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；異位囊壁組、在位內(nèi)膜組患者的TWEAK、Fn14陽性表達(dá)率均明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；異位囊壁組患者的TWEAK、Fn14陽性表達(dá)率與在位內(nèi)膜組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表1）。

2.2 TWEAK、Fn14在EMs患者臨床病理特征中的表達(dá)情況

EMs患者TWEAK、Fn14陽性表達(dá)率在r-AFS、CA-125、EMAb中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表2）。

2.3患者TWEAK、Fn14表達(dá)水平與EMs患者臨床病理特征的相關(guān)性分析

患者的TWEAK、Fn14表達(dá)水平與r-AFS、CA-125、EMAb均成正相關(guān)（r=0.017，P<0.05；r=0.127，P<0.05；r=0.079，P<0.05）。

3討論

EMs是一種激素依賴性疾病，可表現(xiàn)出盆腔疼痛和（或）不孕癥等臨床癥狀[6]。自1927年Sampson提出經(jīng)血逆流種植學(xué)說以來，國(guó)外學(xué)者提出多種學(xué)說來解釋EMs的發(fā)生，但其發(fā)病機(jī)制至今尚未闡明。近年來，免疫系統(tǒng)的異常及其在EMs發(fā)生發(fā)展的作用得到專家學(xué)者的重視[7]。TWEAK及其Fn14受體在EMs中的表達(dá)及功能，為EMs發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)提供理論依據(jù)[8]。TWEAK為腫瘤壞死因子超家族成員之一，白細(xì)胞是TWEAK產(chǎn)生的主要來源，因此在各種炎性疾病或自身免疫性疾病的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷难装Y浸潤(rùn)組織中均可觀察到TWEAK的高表達(dá)[9]。TWEAK通過與受體成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)分子14結(jié)合而發(fā)揮作用[10]。Fn14是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)基因家族成員之一，為Ⅰ型跨膜蛋白。有研究表明TWEAK的異?？赡軈⑴c了EMs的發(fā)病機(jī)制，但其在EMs的具體作用尚不清楚，需進(jìn)一步研究[11]。

本研究利用免疫組織化學(xué)、Western-Blot及RT-PCR檢測(cè)TWEAK、Fn14在不同組別患者中的基因和蛋白表達(dá)水平，結(jié)果提示，50例EMs患者中TWEAK陽性41例，F(xiàn)n14陽性40例，異位囊壁組患者的TWEAK、Fn14陽性表達(dá)率與與在位內(nèi)膜組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），可能是因例數(shù)太少等外在因素影響所致。另外本研究結(jié)果提示，異位囊壁組和在位內(nèi)膜組TWEAK、Fn14陽性表達(dá)率均明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。其原因是TWEAK與Fn14相互作用后，可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)一些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)途徑的活化，包括NF-κB通路（TAK1→Ikkβ→NF-κB→基因表達(dá)）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑（MKKS→ERK1/2、JNKS、p38→AP-1→基因表達(dá)，引起特定基因表達(dá)，從而參與細(xì)胞增生、退化、代謝及死亡[12-13]。此外本研究結(jié)果還提示，TWEAK、Fn14表達(dá)水平與CA-125水平、EMAb、r-AFS成正相關(guān)，該結(jié)論提示EMs患者異位子宮內(nèi)膜TWEAK表達(dá)降低，可導(dǎo)致子宮內(nèi)膜細(xì)胞的凋亡水平下降，原因是TWEAK/Fn14通路協(xié)調(diào)炎癥及祖細(xì)胞應(yīng)答，說明其在急性組織修復(fù)中所起的生理性作用。而在慢性炎癥性疾病模型中，TWEAK/Fn14表現(xiàn)為持續(xù)性活化，促進(jìn)組織損傷，并可能阻礙內(nèi)源性修復(fù)機(jī)制。TWEAK及其受體Fn14在多種腫瘤細(xì)胞與組織中表達(dá)，具有廣泛的生物學(xué)活性，在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖和血管形成，提高細(xì)胞侵襲力，誘導(dǎo)炎癥因子表達(dá)等方面發(fā)揮作用[14]。EMs雖是良性病變，卻具有侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等惡性生物學(xué)行為[15-17]。本研究認(rèn)為子宮內(nèi)膜異位癥治療方式有藥物治療和手術(shù)治療，目前現(xiàn)有藥物治療往往效果不理想，而腹腔鏡手術(shù)治療是首選的手術(shù)方法，若該研究取得預(yù)期效果，可為將來EMs治療提供一種新思路，在減輕患者痛苦、降低治療費(fèi)用、改善生活質(zhì)量、降低不孕癥發(fā)生率等方面，都將會(huì)產(chǎn)生良好的社會(huì)及經(jīng)濟(jì)效益。endprint

綜上所述，TWEAK/Fn14參與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生和發(fā)展，TWEAK/Fn14水平異常可導(dǎo)致子宮內(nèi)膜細(xì)胞的凋亡水平下降。

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