HPLC－PDA法測(cè)定獸藥中非法添加四種解熱鎮(zhèn)痛抗炎類藥物

李慧素，杜紅鴿，吳寧鵬，臧和英，付盼盼

（1.河南省獸藥監(jiān)察所，鄭州450008；2.河南出入境檢驗(yàn)檢疫局，鄭州450003）

解熱鎮(zhèn)痛抗炎類藥物包括非甾體類抗炎藥（如對(duì)乙酰氨基酚、安乃近等）和甾體類糖皮質(zhì)激素類抗炎藥（如地塞米松、地塞米松磷酸鈉等），具有良好的退熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗風(fēng)濕等作用。目前，一些不法企業(yè)受經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使，通過(guò)非法添加解熱鎮(zhèn)痛抗炎類藥物使其獸藥具有了速效、高效、特效的優(yōu)點(diǎn)，從而取得高額利潤(rùn)。由于非法添加行為是隱形的，增強(qiáng)藥效的同時(shí)帶來(lái)了藥量疊加的中毒風(fēng)險(xiǎn)和藥物殘留隱患，通過(guò)食物鏈傳遞，給人體健康造成嚴(yán)重危害［1－3］。為了打擊非法添加的違規(guī)行為，迫切需要建立獸藥制劑中非法添加解熱鎮(zhèn)痛抗炎類藥物的檢測(cè)方法。

目前，對(duì)非法添加的對(duì)乙酰氨基酚、安乃近、氨基比林、安替比林和地塞米松磷酸鈉進(jìn)行了一種或幾種藥物的測(cè)定［4～6］，但還未對(duì)板藍(lán)根注射液、穿心蓮注射液及氟苯尼考粉、替米考星預(yù)混劑等制劑進(jìn)行監(jiān)測(cè)。本文利用二極管陣列檢測(cè)器，建立了高效液相色譜檢查方法，可以有效監(jiān)測(cè)非處方成分的干擾，提高了對(duì)非法添加藥物的定性和定量測(cè)定［7］。

1 材 料

1.1 儀器與試劑 Waters HPLC高效液相色譜系統(tǒng)，包括二極管陣列檢測(cè)器、Empower2色譜工作站；MILIPORE超純水器；METTLER XP205電子天平。甲醇為色譜純，其他均為分析純，水符合實(shí)驗(yàn)室一級(jí)水要求。

1.2 藥品 安乃近對(duì)照品（批號(hào)為H0291105，含量為100.0%）和地塞米松磷酸鈉對(duì)照品（批號(hào)為H0240805，含量為94.7%），均來(lái)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品（批號(hào)為100018－200408，含量為100.0%）和地塞米松對(duì)照品（批號(hào)為100129－200303，含量為100.0%），均來(lái)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。安乃近、對(duì)乙酰氨基酚原料藥均來(lái)自河南某獸藥生產(chǎn)企業(yè)。

氟苯尼考粉，氟苯尼考預(yù)混劑，替米考星預(yù)混劑，磷酸泰樂(lè)菌素預(yù)混劑，穿心蓮注射液，板藍(lán)根注射液，替米考星注射液均來(lái)自市售樣品，經(jīng)檢測(cè)均不含對(duì)乙酰氨基酚、安乃近、地塞米松和地塞米松磷酸鈉。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Waters X－Bridge C18（150×4.6 mm，5 μm）；柱溫 30 ℃；進(jìn)樣量 10 μL。 流速0.8 mL／min；二極管陣列檢測(cè)器，采集波長(zhǎng)為 200～400 nm光譜圖和240 nm波長(zhǎng)處的色譜圖。流動(dòng)相A：磷酸二氫鈉 3.0 g加水至 1000 mL，加三乙胺1 mL，用氫氧化鈉調(diào) pH 值至 7.0±0.2。 流動(dòng)相 B：甲醇。按表1進(jìn)行梯度洗脫。該色譜條件下，四種對(duì)照品出峰時(shí)間順序依次是對(duì)乙酰氨基酚、安乃近、地塞米松磷酸鈉和地塞米松，相鄰色譜峰之間的分離度均符合要求，且色譜峰尖銳對(duì)稱。結(jié)果見(jiàn)圖1。

表1 梯度淋洗表

圖1 4種解熱鎮(zhèn)痛藥物的色譜圖及光譜圖

2.2 溶液配制

2.2.1 對(duì)照品溶液 （臨用前配制）精密稱取對(duì)乙酰氨基酚、安乃近，地塞米松和地塞米松磷酸鈉對(duì)照品各50 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇適量溶解并稀釋至刻度，搖勻作為對(duì)照品貯備液；再分別精密量取2.0 mL于50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 陰性空白溶液 取無(wú)非法添加的各制劑1.0 g或1.0 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇適量溶解（粉散劑需要超聲10 min，并放冷至室溫）。用甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取2.0 mL，置50 mL量瓶中，用80%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，作為陰性空白溶液。

2.2.3 空白添加溶液 取無(wú)非法添加的各制劑，乙酰氨基酚和安乃近分別按1%、2%、5%添加，地塞米松和地塞米松磷酸鈉按 0.15%、0.2%、0.5%添加，照2.2.2項(xiàng)下操作制備成各制劑的陰性對(duì)照溶液。

2.2.4 建立光譜數(shù)據(jù)庫(kù)的溶液 以乙酰氨基酚、安乃近、地塞米松和地塞米松磷酸鈉對(duì)照品溶液（40 μg／mL）作為建立光譜數(shù)據(jù)庫(kù)的溶液。

2.3 峰純度檢查 對(duì)供試品溶液色譜圖中四種解熱鎮(zhèn)痛類藥物色譜峰進(jìn)行峰純度檢查，結(jié)果見(jiàn)圖2和表2。結(jié)果顯示，各陰性空白在240 nm處均無(wú)紫外吸收，對(duì)目標(biāo)分析物無(wú)干擾，四種解熱鎮(zhèn)痛類藥物能達(dá)到很好的分離，且各色譜峰的純度角度均小于純度閾值，表明此色譜條件下，四種解熱鎮(zhèn)痛藥物的出峰位置無(wú)其他干擾峰，為單一物質(zhì)峰，方法可行。

圖2 供試品（酒石酸泰樂(lè)菌素預(yù)混劑）添加解熱鎮(zhèn)痛類藥物純度圖

表2 峰純度檢查結(jié)果表

2.4 光譜相似度檢查 對(duì)供試品溶液中對(duì)乙酰氨基酚、安乃近、地塞米松和地塞米松磷酸鈉的光譜圖與光譜庫(kù)進(jìn)行匹配，匹配角度均小于匹配閾值（表2）。結(jié)果表明，供試品溶液中相應(yīng)色譜峰的光譜與對(duì)乙酰氨基酚、安乃近、地塞米松和地塞米松磷酸鈉光譜庫(kù)的光譜非常相似，可認(rèn)為是同一物質(zhì)。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 溶液穩(wěn)定性 取混合對(duì)照品溶液（50 μg／mL），室溫放置于 0、3、6、9、12、14 h 分別進(jìn)樣測(cè)定，四種解熱鎮(zhèn)痛藥物色譜峰面積RSD均小于0.7%，表明該溶液在14 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.2 線性關(guān)系 精密量取4種解熱鎮(zhèn)痛類藥物的對(duì)照溶液適量，用80%甲醇稀釋成5、10、20、50、100 μg／mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，從低濃度到高濃度依次注入高效液相色譜測(cè)定。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)（表3和圖3）。結(jié)果表明，4種解熱鎮(zhèn)痛類藥物的濃度在5～100 μg／mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

表3 4種解熱鎮(zhèn)痛類藥物的線性方程和相關(guān)系數(shù)

圖3 4種解熱鎮(zhèn)痛類藥物標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.5.3 回收率試驗(yàn) 由于添加回收試驗(yàn)4種解熱鎮(zhèn)痛類藥物使用量較大，考慮用純度符合要求的獸藥原料藥代替對(duì)照品進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，即在空白試樣中分別添加對(duì)乙酰氨基酚和安乃近原料藥，而地塞米松磷酸鈉和地塞米松由于原料價(jià)格昂貴，沒(méi)有搜集到原料，因此用對(duì)照品溶液進(jìn)行添加回收試驗(yàn)。

精密稱取對(duì)乙酰氨基酚和安乃近原料各10、20、50 mg，各置 50 mL量瓶中，加陰性空白 1.0 g或1.0 mL，加甲醇適量，超聲 10 min，放冷，甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取2 mL置50 mL量瓶中，加地塞米松和地塞米松磷酸鈉對(duì)照品貯備液各0.6、0.8、1.0 mL，混勻，加80%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，每個(gè)濃度制備三份平行樣品。計(jì)算回收率及批內(nèi)變異系數(shù)。結(jié)果顯示，對(duì)乙酰氨基酚平均回收率為84.2%～119.2%，安乃近平均回收率為 73.5% ～118.6%，地塞米松磷酸鈉平均回收率為82.5%～115.1%，地塞米松平均回收率為87.9%～115.7%，批內(nèi)變異系數(shù)為0.1%～5.8%，結(jié)果見(jiàn)表4～表10 所示。

表4 穿心蓮注射液中添加4種解熱鎮(zhèn)痛類藥物回收率試驗(yàn)結(jié)果

表5 板藍(lán)根注射液中添加4種解熱鎮(zhèn)痛類藥物回收率試驗(yàn)結(jié)果

表6 氟苯尼考預(yù)混劑中添加4種解熱鎮(zhèn)痛類藥物回收率試驗(yàn)結(jié)果

表7 氟苯尼考粉中添加4種解熱鎮(zhèn)痛類藥物回收率試驗(yàn)結(jié)果

表8 替米考星預(yù)混劑中添加4種解熱鎮(zhèn)痛類藥物回收率試驗(yàn)結(jié)果

表9 磷酸泰樂(lè)菌素預(yù)混劑中添加4種解熱鎮(zhèn)痛類藥物回收率試驗(yàn)結(jié)果

表10 替米考星注射液中添加4種解熱鎮(zhèn)痛類藥物回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.5.4 檢測(cè)限 取混合對(duì)照品溶液適量（建議取1 mL或2 mL）置50 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，梯度稀釋后添加到陰性對(duì)照溶液中，進(jìn)行檢測(cè)，以光譜圖（圖4～圖7）失真的最大濃度作為方法的檢測(cè)限，安乃近和地塞米松磷酸鈉最低檢出濃度 均 為 2 μg／mL， 在 各 制 劑 中 的 檢 測(cè) 限 為3.0 mg／mL（mg／g），對(duì)乙酰氨基酚和地塞米松最低檢出濃度均為1 μg／mL，在各制劑中的檢測(cè)限為1.5 mg／mL（mg／g）。

2.5.5 精密度 取混合對(duì)照品溶液（50 μg／mL），重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果表明：四種成分的保留時(shí)間 RSD小于 0.1%，峰面積 RSD小于1.0%，結(jié)果符合精密度的要求。

2.5.6 耐用性 從柱溫、流動(dòng)相pH值、色譜柱三個(gè)方面考察方法的耐用性。分別改變柱溫為25、30、35 ℃，流動(dòng)相 A 的 pH 值 6.8、7.0、7.2，色譜峰出峰順序無(wú)變化，保留時(shí)間稍有變化；使用不同品牌、不同型號(hào)的色譜柱，如 Thermo Hypersil Gold（4.6×250 mm，5 μm）；Waters XBridge C18（4.6×150 mm，5 μm）；Waters XBridge C18（3.5×150 mm，5 μm）等，結(jié)果四種成分仍能很好地分離且保留時(shí)間合理。在最佳實(shí)驗(yàn)條件的選擇中流速的變化對(duì)四種成分的影響也不大，本方法的耐用性較好。

2.5.7 專屬性 在滿足系統(tǒng)適用性的條件下，4種解熱鎮(zhèn)痛類藥物能夠很好地分離，板藍(lán)根和穿心蓮注射液無(wú)紫外吸收，氟苯尼考、泰樂(lè)菌素和替米考星制劑中主成分和雜質(zhì)均不干擾解熱鎮(zhèn)痛類藥物的檢測(cè)（圖8～圖14）。

圖4 安乃近和地塞米松磷酸鈉的檢測(cè)限光譜圖（3 mg／mL）

圖5 安乃近和地塞米松磷酸鈉的檢測(cè)限色譜圖（3 mg／mL）

圖6 對(duì)乙酰氨基酚和地塞米松的檢測(cè)限光譜圖（1.5 mg／mL）

圖7 對(duì)乙酰氨基酚和地塞米松的檢測(cè)限色譜圖（1.5 mg／mL）

圖8 板藍(lán)根注射液空白及空白添加色譜圖

圖9 穿心蓮注射液空白及空白添加色譜圖

圖10 氟苯尼考預(yù)混劑空白及空白添加色譜圖

圖11 氟苯尼考粉空白及空白添加色譜圖

圖12 酒石酸泰樂(lè)菌素預(yù)混劑空白及空白添加色譜圖

圖13 替米考星注射液空白及空白添加色譜圖

圖14 替米考星預(yù)混劑空白及空白添加色譜圖

3 討論與小結(jié)

3.1 稀釋溶劑的選擇 本方法先后選擇了甲醇［8］、80%甲醇、50%甲醇對(duì)標(biāo)準(zhǔn)貯備液進(jìn)行稀釋，經(jīng)測(cè)定發(fā)現(xiàn)，50%的甲醇為溶劑時(shí)，安乃近降解比較快，產(chǎn)生另外一種物質(zhì)；甲醇和80%甲醇溶液為溶劑時(shí)，安乃近基本未發(fā)生降解。同時(shí)文獻(xiàn)［9］也證實(shí)，安乃近在水溶液、體內(nèi)及加熱的條件下極不穩(wěn)定，主要產(chǎn)生MAA（4－甲氨基安替比林）的降解產(chǎn)物。而甲醇為溶劑時(shí)，個(gè)別色譜柱會(huì)出現(xiàn)峰型不對(duì)稱的現(xiàn)象。因此，試驗(yàn)選擇了80%的甲醇作為稀釋溶劑，并建議樣品溶液在14 h內(nèi)完成測(cè)定。

3.2 流動(dòng)相洗脫方式的選擇 由于地塞米松和對(duì)乙酰氨基酚、安乃近極性差別較大，采用等度洗脫時(shí)，對(duì)乙酰氨基酚很快出峰，地塞米松很晚出峰甚至無(wú)法洗脫出來(lái)，當(dāng)采用梯度洗脫［5］時(shí)，可以使4種解熱鎮(zhèn)痛類藥物很好的分離，分離度均大于3.0，峰型對(duì)稱。因此，選擇梯度洗脫的方式進(jìn)行測(cè)定，并且該梯度條件亦可適用于超高效液相色譜測(cè)定。

3.3 添加回收濃度選擇與結(jié)果分析 由于四種藥物藥效濃度不同，在獸藥制劑中的添加量也不同。由于摻假過(guò)程復(fù)雜，實(shí)際添加比例是未知的，為模擬獸藥制劑的非法添加情況，本研究在做添加回收試驗(yàn)時(shí)，以各藥物在制劑規(guī)格的1%、2%、5%作為三個(gè)添加濃度。

試驗(yàn)過(guò)程中，由于安乃近容易降解產(chǎn)生MAA，隨著樣品溶液放置時(shí)間的延長(zhǎng)，容易造成安乃近的回收率偏低；而地塞米松和地塞米松磷酸鈉采用標(biāo)準(zhǔn)溶液添加，定量添加的標(biāo)準(zhǔn)溶液體積是造成低濃度添加回收結(jié)果偏低的主要原因。

本方法采用二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定，實(shí)現(xiàn)可以檢測(cè)6種制劑的主成分是否干擾對(duì)乙酰氨基酚、安乃近、地塞米松和地塞米松磷酸鈉，同時(shí)可以通過(guò)峰純度檢查確保添加藥物出峰處無(wú)干擾，再經(jīng)光譜相似度檢查鎖定非法添加藥物，同時(shí)通過(guò)保留時(shí)間與對(duì)照品進(jìn)行比對(duì)相佐證，實(shí)現(xiàn)獸藥中非法添加物的高效、快速、準(zhǔn)確識(shí)別。通過(guò)方法學(xué)考察，本方法可以用于獸藥中對(duì)乙酰氨基酚、安乃近、地塞米松和地塞米松磷酸鈉的檢測(cè)。

［1］楊秀玉，萬(wàn)仁玲，馬玉葉，等.高效液相色譜法定性檢測(cè)5種中獸藥散劑中違規(guī)添加的氯霉素［J］.中國(guó)獸藥雜志，2006，40（12）： 11－14.

［2］李 銳.中成藥、保健食品中非法添加化學(xué)成分的檢測(cè)［J］.中國(guó)藥業(yè)，2007， 16（18）：10－11.

［3］周 媛，貢玉清，邵德佳.有關(guān)中獸藥中非法添加化學(xué)藥物的探討［J］.中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志， 2010， 29（4）： 28－31.

［4］農(nóng)業(yè)部1848號(hào)公告－黃芪多糖注射液中非法添加解熱鎮(zhèn)痛類、抗病毒類、抗生素類、氟喹諾酮類等11種化學(xué)藥物（物質(zhì)）檢查方法［S］.

［5］農(nóng)業(yè)部2508號(hào)公告－1－注射用青霉素鉀（鈉）中非法添加解熱鎮(zhèn)痛藥物檢查方法［S］.

［6］農(nóng)業(yè)部1956公告.乳酸環(huán)丙沙星注射液中非法添加對(duì)乙酰氨基酚檢查方法［S］.

［7］劉 寶，周莉莉，王 駿，等.基于二極管陣列檢測(cè)器的色譜峰純度的快速直觀鑒定［J］.光譜實(shí)驗(yàn)室， 2011， 28（4）： 1684－1689.

［8］中國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸藥典（2010年版）一部［S］.

［9］郝利華，于曉輝，董玲玲，等.HPLC－PDA法同時(shí)測(cè)定黃芪多糖注射液中非法添加的四種解熱鎮(zhèn)痛類藥物［J］.中國(guó)獸藥雜志，2014， 46（8）： 28－31.