雞產(chǎn)蛋下降綜合癥病毒快速純化及其多抗血清制備

孫 蘋，陳 倩，胡序明，葉建強(qiáng)，3，邵紅霞，3，錢 琨，3，秦愛建，3?

（1.揚(yáng)州大學(xué)江蘇省動物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室，江蘇揚(yáng)州225009；2.揚(yáng)州大學(xué)教育部禽類預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室，江蘇揚(yáng)州225009；3.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州225009）

雞產(chǎn)蛋下降綜合癥（Egg Drop Syndrome-76，EDS-76）也稱減蛋綜合癥，是由禽腺病毒Ⅲ群引起的病毒性傳染病，幼齡雞感染后無臨床癥狀，亦很難查到抗體［1］，開產(chǎn)之后表現(xiàn)出群發(fā)性產(chǎn)蛋量下降及蛋品質(zhì)下降的癥狀，其中產(chǎn)蛋量下降率最高達(dá)30%，蛋殼破損率最高也達(dá)40%，已被列為雞四大病毒性傳染病之一，但目前該病尚無有效的治療方法，只能使用滅活苗等進(jìn)行預(yù)防或加強(qiáng)管理措施［2］。

對該病病原及多抗血清進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化所得的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是腺病毒檢測分析和臨床檢驗中不可或缺的實(shí)物對照，但目前尚無EDS-76標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)方面的報道。

目前在EDS-76病毒純化中應(yīng)用較為廣泛的是蔗糖梯度超速離心［3］，本研究在蔗糖梯度超速離心過程中發(fā)現(xiàn)了一種更為簡便的病毒純化方法，同時成功獲得了高效價的EDS-76雞多抗血清，對進(jìn)一步開展EDS-76病毒的診斷研究具有一定的意義。

1 材料與方法

1.1 病毒、血清、SPF胚和細(xì)胞 EDS-76毒株AV-127株（CVCC AV115）、EDS-76 陽性血清（CVCC Z43）購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心，SPF鴨胚購自哈爾濱獸醫(yī)研究所，MSB1、DF1、VERO細(xì)胞由本實(shí)驗室保存，CEF、DEF、GEF、CEK 細(xì)胞按文獻(xiàn)方法［4-5］制備，禽白血病病毒（ALV）、小鵝瘟病毒（GPV）、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒（REV）、雞馬立克氏病病毒（MDV）、雞傳染性支氣管炎（IBV）、禽傳染性貧血病病毒（CAV）、雞傳染性法氏囊病毒（IBDV）、鴨坦布蘇病毒（TMUV）、禽呼腸孤病毒（REOV）等細(xì)胞適應(yīng)毒分別由本實(shí)驗室保存，1%雞紅細(xì)胞按文獻(xiàn)方法［4-5］制備。

1.2 主要儀器和試劑 Tecnai12透射電鏡購自荷蘭Philips公司；超速離心機(jī)由揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院公共實(shí)驗平臺提供；PEG-6000購自上海生物工程公司；Taq酶購自上海生物工程公司；HRP標(biāo)記的兔抗雞IgY、FITC標(biāo)記的兔抗雞IgY、FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自Sigma公司；SuperSignal West Pico化學(xué)發(fā)光底物購自Fermentas公司。

1.3 病毒擴(kuò)增 AV-127病毒原液用細(xì)胞級PBS緩沖液進(jìn)行50倍稀釋，加入青霉素、鏈霉素各1000單位／mL。取10日齡SPF鴨胚10枚，尿囊腔接種病毒液，0.2 mL／枚，38℃孵化箱培養(yǎng)120 h，棄去24 h之內(nèi)的死亡胚，胚體進(jìn)行病變檢查，無菌收取尿囊液，尿囊液作血凝性鑒定［6-8］。收集的尿囊液接種10日齡SPF鴨胚50枚，按上述方法復(fù)傳一代。

1.4 病毒純化 取凍存于-20℃的尿囊液100 mL快速融化，4℃ 5000 r／min離心20 min，棄雜質(zhì)，用1∶1的氯仿∶尿囊液混勻抽提3次。抽提后的尿囊液裝入透析袋，PEG-6000濃縮50倍，靜置1 h，離心取沉淀作為純化病毒1；上清進(jìn)行蔗糖梯度超速離心［9］，100000 g離心2.5 h，取沉淀作為純化病毒2。

1.5 病毒特性比較

1.5.1 電鏡觀察 分別將純化病毒1與純化病毒2用細(xì)胞級PBS緩沖液重懸，備用。兩種備用溶液分別取一滴滴于銅網(wǎng)上吸附10 min，2%磷鎢酸常規(guī)染色［10］，Tecnai12透射電鏡下觀察拍照。

1.5.2 PCR鑒定 參考GenBank上發(fā)表的AV-127病毒的全基因序列（序列號AC_000004）針對保守序列六鄰體（全長2733 bp）設(shè)計兩對引物Ⅰ、Ⅱ送至上海英駿生物技術(shù)公司（Invitrogen）進(jìn)行合成［11-12］，引物序列如下：

Ⅰ-F：5’-GCTCGAGATGGAACCCCAACGTGAAT-3’

Ⅰ-R：5’-GAATTCTCATGTTGCTGCACTACCG-3’

Ⅱ-F：5’-ATCCTGTTTATGAATGGGTA-3’

Ⅱ-R：5’-TATCGTCGGTCAGAGTTA-3’

分別從兩種途徑制備的病毒重懸液中提取AV-127病毒的DNA基因組，進(jìn)行基因擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為：95℃ 5 min；94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，30個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

1.5.3 血凝效價測定 兩種途徑制備的病毒懸液作HA效價檢測，血凝試驗步驟參考文獻(xiàn)［4-5］。

1.6 多抗血清制備 30日齡SPF雞10只，采取滴鼻0.5 mL、點(diǎn)眼0.5 mL、口服1 mL等自然感染途徑使雞攝入 AV-127病毒尿囊原液，免疫總劑量2 mL／只，首免后，每隔2W以相同方法和劑量加強(qiáng)免疫。每次免疫10 d后，靜脈采血，分離血清，測血凝效價。6免后12 d心臟無菌采血分離血清，-20℃保存。

1.7 多抗血清鑒定

1.7.1 HI效價測定 制備的多抗血清作HI效價測定，采用購買的EDS-76陽性血清作為對照，血凝抑制試驗步驟參考文獻(xiàn)［4-5］。

1.7.2 Western-blot反應(yīng)性 以購買的AV-127株病毒作為蛋白樣品，稀釋定量后按1∶6的比例加入樣品緩沖液，煮沸10 min，電泳后進(jìn)行轉(zhuǎn)印，4℃封閉過夜。制備的多抗血清、購買的陽性血清、SPF雞陰性血清分別1∶100稀釋作為一抗，HRP標(biāo)記的兔抗雞IgY作為二抗，化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行發(fā)光，化學(xué)發(fā)光儀掃描獲得結(jié)果圖。

1.7.3 IFA效價測定 96孔板培養(yǎng)AV-127病毒感染的DEF細(xì)胞，96 h后進(jìn)行間接免疫熒光。制備的多抗血清進(jìn)行 1 ∶250、1 ∶500、1 ∶1000、1∶2000、1∶4000稀釋，作為一抗，同時設(shè) SPF雞陰性血清為陰性對照，37℃孵育 1 h［13-15］。 FITC標(biāo)記的兔抗雞IgY作為二抗，37℃孵育45 min。封孔，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.7.4 多抗血清特異性鑒定 采用HI以及IFA的方法鑒定常見禽類病毒與AV-127多抗血清的反應(yīng)性，同時采用相應(yīng)病毒的抗體作為陽性對照（表1）。

表1 多抗血清特異性鑒定

2 結(jié)果

2.1 病毒擴(kuò)增 AV-127病毒在SPF鴨胚上傳兩代均未見鴨胚死亡和明顯的胚體病變，僅個別鴨胚頭頸部出現(xiàn)輕微出血點(diǎn)，第一代鴨胚尿囊液HA平均效價為12Log2，第二代鴨胚尿囊液HA平均效價為13Log2。

2.2 病毒純化 電鏡觀察發(fā)現(xiàn)兩種途徑得到的病毒懸液電鏡結(jié)果如圖1所示：僅用氯仿和PEG-6000處理獲得的病毒粒子形態(tài)、大小一致，呈球形，直徑約為70～80 nm，背景清晰，殼粒明顯；而傳統(tǒng)的蔗糖超速離心純化方法得到的病毒則含量稀少，形態(tài)模糊。

圖1 AV-127病毒電鏡觀察結(jié)果

2.3 PCR鑒定 分別從純化病毒1和純化病毒2中提取核酸，用引物Ⅰ、Ⅱ分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，與1 kb DNA Marker對照，結(jié)果如圖2所示：兩種方法制備的病毒均出現(xiàn)背景清晰、分子大小為2733 bp及918 bp的特異性DNA條帶。

2.4 血凝效價測定 傳統(tǒng)蔗糖超速離心純化方法獲得的病毒懸液經(jīng)HA測定，效價為16Log2，比原尿囊液滴度高了3個血凝單位；而氯仿PEG處理方法獲得的病毒懸液經(jīng)HA測定，效價為19Log2，比原尿囊液滴度高了6個血凝單位。

圖2 AV-127病毒PCR結(jié)果

2.5 多抗血清制備及鑒定

2.5.1 HI效價測定 用上述方法制備的多抗血清經(jīng)HI鑒定，平均效價為13Log2，以已知陽性血清作對照，HI效價為11Log2，可見本研究制備的多抗血清比購買的多抗HI效價高2個血凝單位，說明本研究制備的多抗血清具有良好的反應(yīng)性。

2.5.2 Western-blot結(jié)果 Western-blot分析結(jié)果顯示：本研究制備的多抗血清和購買的陽性血清均能與AV-127病毒兩條分子大小在50 kD至85 kD之間的蛋白條帶發(fā)生特異性反應(yīng)，而SPF雞陰性血清未見此特異性條帶，說明本研究制備的多抗血清與購買的陽性血清具有相同的反應(yīng)譜（圖3）。

圖3 AV-127病毒的Western-blot結(jié)果圖

2.5.3 IFA效價測定 本研究制備多抗血清作倍比稀釋后與AV-127感染96 h的DEF細(xì)胞進(jìn)行間接免疫熒光試驗，同時設(shè)SPF雞陰性血清作對照。結(jié)果顯示1∶1000血清稀釋度下的細(xì)胞與對照細(xì)胞相比熒光適當(dāng)、背景清晰；1∶2000血清稀釋度下的細(xì)胞與對照細(xì)胞相比熒光較弱，1∶4000血清稀釋度下基本無熒光，所以該多抗血清的間接免疫熒光效價為1∶2000?？紤]到該多抗血清臨床使用效果，根據(jù)上述試驗結(jié)果進(jìn)行綜合評價，將該批多抗血清的IFA臨床使用稀釋度定為1∶1000。部分結(jié)果如圖4所示。

2.5.4 多抗血清特異性鑒定 本研究制備的多抗血清與 NDV、AIV、ALV-A、ALV-J、GPV、REV、MDV、IBV、CAV、IBDV、TMUV、REOV 等病毒反應(yīng)均呈陰性，而與AV-127株反應(yīng)成陽性，說明該多抗血清具有良好的特異性（表2）。

表2 多抗血清特異性鑒定結(jié)果

圖4 不同血清稀釋度下的細(xì)胞與正常對照細(xì)胞免疫熒光分析

3 討論

減蛋綜合癥作為雞的四大病毒性傳染病之一，已引起科研學(xué)者的高度重視。該病發(fā)病期間無明顯臨床癥狀，僅在開產(chǎn)后引起產(chǎn)蛋率大幅度下降及蛋品質(zhì)下降，這為我們進(jìn)行病毒檢測、預(yù)防控制病情的發(fā)生帶來了困難。本研究建立了純化病毒的新方案，成功獲得了高效價的多抗血清，這是研發(fā)標(biāo)準(zhǔn)抗原抗體、建立快速可供推廣應(yīng)用的實(shí)驗室診斷方法、控制該病的發(fā)生與流行等必不可少的步驟。

傳統(tǒng)的蔗糖梯度離心需要在超速離心管底鋪設(shè)蔗糖梯度，超離之后每一層蔗糖梯度里都會殘留病毒，造成損失，而本研究建立的病毒純化方法能夠避免這種損失，使得制備的病毒含量大大提高；超速離心機(jī)的使用費(fèi)時費(fèi)力，本方法簡單易操作；從電鏡結(jié)果來看該方法比傳統(tǒng)方法所制備的病毒背景更加純粹、形態(tài)也更加清晰。另一方面，因為本方案中的病毒由濃縮而來，初步斷定該方法對病毒的濃縮倍數(shù)有一定要求，同樣地，該方法是否可以用于其他病毒的純化，不同病毒純化時的濃縮倍數(shù)是否不同，這些都有待于后續(xù)研究。

血凝及血凝抑制試驗是檢測EDS-76病毒及多抗血清的首選方法［16］，它操作方便簡單，但HA及HI陽性標(biāo)準(zhǔn)至今沒有統(tǒng)一的說法，因此本研究在測定HA及HI效價的前提下選用了間接免疫熒光，間接免疫熒光也是EDS-76病毒檢測中的常用方法，該方法結(jié)果精準(zhǔn)可靠，陽性標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一［17］。但其抗體的特異性決定了檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。所以本研究成功獲得多抗血清之后對多抗血清進(jìn)行了特異性鑒定，未檢出 NDV、AIV-A、ALV-J、ALV、GPV、REV、MDV、IBV、CAV、IBDV、TMUV、REOV 等病毒的抗體，說明本研究制備多抗血清特異性良好。

目前尚無關(guān)于EDS-76的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)方面的具體報道，首選的血清學(xué)診斷方法即血凝抑制試驗中HI陽性也沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，隨著對病毒檢測技術(shù)靈敏性需求的不斷提高，對診斷試劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制也是迫在眉睫。對多抗血清的制備和標(biāo)定，尤其是利用間接免疫熒光所進(jìn)行的特異性標(biāo)定是制備高特異性標(biāo)準(zhǔn)多抗血清的前提。本研究所制備的病毒和多抗血清還需要進(jìn)一步標(biāo)定。

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