長春市市售豬肉雞肉中金黃色葡萄球菌和沙門氏菌分離及耐藥性分析

王 瑩，陳 萍，王佳男，馮書章，郭學(xué)軍

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，長春130118；2.解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，長春130122）

金黃色葡萄球菌和沙門氏菌是我國食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中食品衛(wèi)生微生物常規(guī)檢測項目，是常見食物中毒致病菌。在我國的細(xì)菌性食物中毒事件中，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒占四分之一，居于第四位，由沙門氏菌引起的食物中毒屢居首位［1］。近年來，耐藥性沙門氏菌和金黃色葡萄球菌開始出現(xiàn)，并呈現(xiàn)上升趨勢［2-3］。據(jù)統(tǒng)計，中國病原菌耐藥性增長率在全世界是最快的［4］。在畜禽上抗生素的大量使用或濫用，在抗生素選擇性壓力下，不僅會造成致病菌對抗菌類藥物耐藥性和交叉耐藥的產(chǎn)生，而且有研究表明抗生素治療可能會延長感染動物病情［5］?？刂苿游镌葱约?xì)菌耐藥性的產(chǎn)生及傳播是解決人類日益嚴(yán)重耐藥性問題的重要環(huán)節(jié)。目前，左旋氧氟沙星（氟喹諾酮類抗生素）、頭孢類藥物（β-內(nèi)酰胺類抗生素）和慶大霉素（氨基糖苷類抗生素）是國內(nèi)臨床治療沙門氏菌或葡萄球菌感染的一線藥物，四環(huán)素（四環(huán)素類抗生素）為畜禽飼喂過程中常用藥物。

自2013年6月到2014年3月對吉林省長春市超市及農(nóng)貿(mào)市場中生鮮雞肉、豬肉進(jìn)行沙門氏菌和金黃色葡萄球菌分離鑒定及耐藥性分析，以期為進(jìn)一步對食品中沙門氏菌和金黃色葡萄球菌進(jìn)行風(fēng)險評估奠定科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基和試劑 SC增菌液（20130918）、XLD培養(yǎng)基（20121107）、BS 培養(yǎng)基（20130516）、BP 培養(yǎng)基（20121126）、M-H 培養(yǎng)基（20120610）、蛋白胨（20120816），購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；磷酸二氫鈉（20111118）、磷酸氫二鈉（20130107）、氯化鈉（20120910），購自北京化工廠；dNTPs、DNAMarker，購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；Taq酶（2000U）購自長春鼎國生物工程技術(shù)有限公司。

1.2 抗生素 頭孢噻肟鈉（CefotaximeSodium，CEX）、左旋氧氟沙星（Levofloxacin，LVX）、慶大霉素（Gentamicin，GEN）、四環(huán)素（Tetracycline，TET），購自長春鼎國生物工程技術(shù)有限公司。其中慶大霉素含量為 694 μg／mg，其余抗生素含量均為＞900 μg／mg。

1.3 質(zhì)控菌株 大腸桿菌（ATCC25922）、金黃色葡萄球菌（ATCC29213），購自吉林省檢驗院。

1.4 金黃色葡萄球菌、沙門氏菌的分離 分別按GB 4789.10-2010和GB 4789.4-2010從市售的豬肉、雞肉分離金黃色葡萄球菌和沙門氏菌。

1.5 金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的鑒定 采用PCR方法代替?zhèn)鹘y(tǒng)的生化方法對金黃色葡萄球菌和沙門氏菌分離株進(jìn)行鑒定，使用引物invA對沙門氏菌進(jìn)行鑒定，引物nuc對金黃色葡萄球菌進(jìn)行鑒定，引物序列見表1。

表1 引物序列及PCR產(chǎn)物

1.6 藥敏試驗 按照 SN／T 1944—2007［6］制作藥敏紙片，進(jìn)行藥敏試驗，按照 CLSI2010［7］對藥敏結(jié)果進(jìn)行判定。

2 結(jié)果與分析

2.1 肉品中金黃色葡萄球菌、沙門氏菌污染情況

按照國標(biāo)方法從樣品中分離金黃色葡萄球菌和沙門氏菌，金黃色葡萄球菌總檢出率為46%（46／100），雞肉中檢出率為 44.29%（31／70）；豬肉中檢出率為 50%（15／30）。沙門氏菌總檢出率為16.84%（48／285），雞肉中檢出率為 21%（42／200）；豬肉中檢出率為7.06%（6／85），結(jié)果如表2所示。

表2 金黃色葡萄球菌和沙門氏菌分離情況

2.2 肉品中金黃色葡萄球菌、沙門氏菌耐藥率結(jié)果 利用K-B法檢測分離到的金黃色葡萄球菌和沙門氏菌對4種抗生素的耐藥性。試驗結(jié)果表明，金黃色葡萄球菌對左旋氧氟沙星的耐藥率為56.52%（26／46）最為普遍，其次為四環(huán)素50%（23／46），對頭孢噻肟鈉耐藥率較低，為 8.7%（4／46）。所有菌株均對慶大霉素敏感，耐藥率為0。豬肉和雞肉中分離到的金黃色葡萄球菌均對頭孢噻肟鈉、左旋氧氟沙星和四環(huán)素具有耐藥性（表3）。雞肉中金黃色葡萄球菌菌株對四環(huán)素、左旋氧氟沙星的耐藥率高于50%，對頭孢噻肟鈉耐藥率為9.68%；豬肉中金黃色葡萄球菌菌株對四環(huán)素、左旋氧氟沙星均低于50%，對頭孢噻肟鈉耐藥率僅為6.67%。

表3 金黃色葡萄球菌耐藥性檢測結(jié)果

試驗中分離到的48株沙門氏菌對各種抗生素的耐藥率在16.67%～87.5%之間。其中對四環(huán)素耐藥率最高，為87.5%（42／48）。沙門氏菌對四種抗生素總耐藥率依次為四環(huán)素（87.5%）＞慶大霉素（54.17%）＞頭孢噻肟鈉（25%）＞左旋氧氟沙星（16.67%）（表4）。雞肉中沙門氏菌菌株對四環(huán)素和慶大霉素的耐藥率高于50%，對頭孢噻肟鈉和左旋氧氟沙星的耐藥率均低于30%；豬肉中沙門氏菌菌株四環(huán)素耐藥率高達(dá)100%，慶大霉素耐藥率為50%，對左旋氧氟沙星耐藥率為16.67%，對頭孢噻肟鈉敏感率為100%。

表4 沙門氏菌藥耐藥性檢測結(jié)果

2.3 肉品中金黃色葡萄球菌、沙門氏菌多重耐藥結(jié)果

2.3.1 金黃色葡萄球菌多重耐藥結(jié)果 金黃色葡萄球菌對4種抗生素共產(chǎn)生了6種耐藥譜。優(yōu)勢耐藥譜為LVX、TET和LVX-TET譜型。大部分菌株具有耐藥性，分離株耐藥率達(dá)到78.26%，耐藥譜顯示金黃色葡萄球菌對四環(huán)素和左旋氧氟沙星耐藥較高。經(jīng)過多重耐藥分析發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌有10株對4種抗生素完全敏感，22株僅對其中的1種抗生素耐藥，14株對2種抗生素耐藥，2株對3種抗生素耐藥，多重耐藥率為4.35%（2／46）（表5）。

表5 金黃色葡萄球菌多重耐藥及耐藥譜結(jié)果

2.3.2 沙門氏菌多重耐藥結(jié)果 試驗中分離到的48株沙門氏菌對4種抗生素產(chǎn)生9種耐藥譜，相對優(yōu)勢譜型為 GEN-TET、CEX-GEN-TET和CEXGEN-LVX-TET。本研究中沙門氏菌分離株耐藥率達(dá)到93.75%，29株（60.41%）對2種以上抗生素具有耐藥性，12株（25%）對至少3種抗生素具有耐藥性。沙門氏菌有3株對4種抗生素均敏感，16株僅對1種抗生素耐藥，17株對2種抗生素耐藥，7株對3種抗生素耐藥，5株對所用4種抗生素均有耐藥性（表6）。

表6 沙門氏菌多重耐藥及耐藥譜

3 討論

致病菌的污染會發(fā)生在處理、加工、包裝及分配各個環(huán)節(jié)中，雞肉分割期間腸道破裂，肉品銷售場所衛(wèi)生環(huán)境惡劣等均會導(dǎo)致污染。本試驗結(jié)果顯示，自2013年6月到2014年3月采集的豬肉和雞肉樣品中，金黃色葡萄球菌檢出率為46%，沙門氏菌檢出率為16.84%。于宏偉［8］等雞肉中金黃色葡萄球菌的檢出率為44.83%，豬肉中金黃色葡萄球菌的檢出率僅為19.77%。張芳［9］等報道2772份食品樣品中沙門氏菌在各類食品中的檢出率為9.15%。李秀桂［10］等對廣西生畜肉食源性沙門氏菌污染檢測分析結(jié)果為 12.5%～45.83%，生禽肉6.25%～31.25%。以上報道均表明我國的各類市售畜禽肉類均存在病原菌的污染現(xiàn)象。

近年來，耐藥性的出現(xiàn)及耐藥率的持續(xù)上升，給臨床預(yù)防和治療沙門氏菌感染帶來很大挑戰(zhàn)。本試驗對獲得的沙門氏菌和金黃色葡萄球菌進(jìn)行藥敏試驗，結(jié)果表明金黃色葡萄球菌對氟喹諾酮類藥物和四環(huán)素類藥物的耐藥率偏高，分別達(dá)到56.25%和50%，對頭孢噻肟鈉耐藥率雖然相對較低，也應(yīng)對其給予重視；沙門氏菌對4種抗生素均呈現(xiàn)不同程度的耐藥性，對四環(huán)素耐藥率達(dá)到87.5%。略低于王文俠［11］等報道的貴陽市雞肉分離的沙門氏菌對頭孢噻肟鈉、氧氟沙星、慶大霉素、四環(huán)素耐藥率，分別為 71.4%、42.9%、78.5%、100%；與吳云鳳［12］等報道結(jié)果相似。總體看來，本研究中來源于雞肉中的金黃色葡萄球菌和沙門氏菌耐藥率高于來源于豬肉中的菌株。這可能是因為我國家禽規(guī)?；曫B(yǎng)較早，與抗生素長期作為雞飼料添加劑被用于預(yù)防疾病和生長促進(jìn)劑有關(guān)。細(xì)菌耐藥性多為獲得性耐藥，畜禽飼喂過程中抗生素的不合理使用會導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。經(jīng)多次無抗生素壓力傳代，部分耐藥性會逐漸消失，所以在畜禽飼喂過程中應(yīng)合理使用抗生素，不宜持續(xù)使用同一類抗生素。

值得關(guān)注的是，試驗中分離到的金黃色葡萄球菌和沙門氏菌均存在多重耐藥性。4.35%的金黃色葡萄球菌對3種抗生素具有耐藥性，25%的沙門氏菌對3種及3種以上抗生素具有耐藥性。國內(nèi)還有許多對金黃色葡萄球菌和沙門氏菌多重耐藥性的報道。徐本錦［13］等報道金黃色葡萄球菌多重耐率達(dá)到88.52%。張秀麗［14］等對河南省生雞肉分離的沙門氏菌進(jìn)行耐藥研究，58.5%對3種以上抗生素具有耐藥性。鄒立扣［15］等對18株豬肉中分離的沙門氏菌進(jìn)行藥敏試驗，27.78%對3種以上抗生素具有耐藥性?？梢?，國內(nèi)金黃色葡萄球菌和沙門氏菌多重耐藥現(xiàn)象普遍。報道結(jié)果的不同可能是因為采樣數(shù)量、采樣地區(qū)和所選用抗生素種類的差異造成的。隨著抗生素耐藥性的進(jìn)一步加劇，很多致病菌已經(jīng)產(chǎn)生了嚴(yán)重的多重耐藥現(xiàn)象。人一旦感染多重耐藥菌，臨床治愈難度會增大。

［1］劉秀梅.食源性疾病監(jiān)控技術(shù)的研究［J］.中國食品衛(wèi)生雜志，2004，16（1）：3-9.

［2］Dogru A K， Ayaz N D， Gencay Y E.Serotype identification and antimicrobial resistance profiles of Salmonella spp.isolated from chicken carcasses［ J］.Tropical animal health and production，2010， 42（5）： 893-897.

［3］Gomes-Neves E，Antunes P，Manageiro V，et al.Clinically relevant multidrug resistant Salmonella enterica in swine and meat handlers at the abattoir［J］.Veterinary microbiology， 2014， 168（1）： 229-233.

［4］Zhang R，Eggleston K，Rotimi V，et al.Antibiotic resistance as a global threat： evidence from China， Kuwait and the United States［J］.Global Health， 2006， 2（1）： 6.

［5］Emily K.Weir， Laura C.Martin， Cornells Poppe， et al.Subinhitory concentrations of tetracycline DT104［J］.Microbes ande Infection，2008，10： 901-907.

［6］SN／T 1944-2007動物及其制品中細(xì)菌耐藥性的測定紙片擴(kuò)散法［S］.

［7］CLSI， 2010.Clinical and Laboratory Standards Institute.20th Informational Supplement， vol.30.No.1， M100-S20.Wayne，PA.USA.

［8］于宏偉，郭潤芳，賈英民.食品中金黃色葡萄球菌的分布及相關(guān)毒力基因的表達(dá)研究［J］.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2014，37（1）： 87-93.

［9］張 芳，馬國柱，潘 立，等.陜西省2002-2006年食源性致病菌污染狀況［J］.中國公共衛(wèi)生， 2008， 24（2）： 222-224.

［10］李秀桂，黃 彥，唐振柱，等.南寧市生食蔬菜中病原菌污染監(jiān)測［J］.應(yīng)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2008，14（6）： 361-363.

［11］王文俠，譚艾娟，呂世明，等.貴陽市豬肉中沙門氏桿菌的耐藥性檢測［J］.貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2011， 39（4）：133-135.

［12］吳云鳳，袁寶君，喬 昕，等.肉雞胴體中沙門氏菌的分離鑒定及多重耐藥譜研究 ［［J］.南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2012，32（1）： 125-128.

［13］徐本錦，張偉松，王 新，等.陜西省市售雞肉中金黃色葡萄球菌的毒力基因及其藥敏檢測［J］.中國人獸共患病學(xué)報，2012， （11）： 22-26.

［14］張秀麗，楊保偉，廖興廣，等.河南省鶴壁市食源性和禽源性沙門氏菌耐藥性研究［J］.中國人獸共患病學(xué)報，2010（12）：1134-1136.

［15］鄒立扣，蒲妍君，楊 莉，等.四川省豬肉源大腸桿菌和沙門氏菌的分離與耐藥性分析［J］.食品科學(xué)，2012，33（13）：202-206.