苦參堿的提取純化工藝研究

郭德祥，郭亞楠，李向陽(yáng)

(國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心，河南洛陽(yáng)471003)

苦參為豆科植物苦參(Sophora flavescens Ait.)的干燥根，具有清熱燥濕、殺蟲利尿的功效［1－2］，臨床上常用于治療豬感冒、無(wú)名高熱，仔豬白痢，家兔疥癬，雞球蟲病等。現(xiàn)代研究表明，苦參主要的有效成分為苦參堿、氧化苦參堿等生物堿［3］，本研究采用最為方便、易于工業(yè)化生產(chǎn)的水煎煮法，以浸膏得率、苦參堿提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過正交試驗(yàn)篩選苦參提取的最佳工藝條件，為新藥研究和充分利用苦參藥材資源提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 依利特高效液相色譜儀(P230型高壓輸液泵;UV230型檢測(cè)器;EC2000色譜工作站);ZORBAX NH2色譜柱，4.6 mm ×250 mm，5 μm(Agilent公司，美國(guó));Ab265－s電子分析天平(梅特勒－托利多公司，瑞士)。

1.2 儀器 苦參，購(gòu)自洛陽(yáng)康鑫中藥飲片公司，符合《中華人民共和國(guó)獸藥典》二○一○年版二部苦參項(xiàng)下的有關(guān)規(guī)定［4］;苦參堿對(duì)照品，批號(hào):110805－200507，由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供;乙腈為色譜純，水為重蒸水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定方法 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn):ZORBAX NH2柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);以乙腈－無(wú)水乙醇－3%磷酸溶液(80∶10∶10)為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm。理論板數(shù)按苦參堿峰計(jì)算應(yīng)不低于1500。

線性范圍考察:精密稱取苦參堿對(duì)照品20.9 mg于100 mL容量瓶中，加乙腈－無(wú)水乙醇(80:20)溶解、定容，制成濃度為209 μg/mL的儲(chǔ)備液，將上述儲(chǔ)備液用乙腈－無(wú)水乙醇(80∶20)稀釋成濃度分別為 104.5、52.2、26.1、13.1 μg/mL 的對(duì)照品溶液，分別精密吸取上述5個(gè)不同濃度的對(duì)照品溶液10 μL，以峰面積(Y)與對(duì)照品濃度(X)進(jìn)行線性回歸，回歸方程為 Y=4396.7X －0.8696，r=0.9999。表明在 0.13 ～2.09 μg范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

對(duì)照品溶液的制備:精密稱取5 mg苦參堿對(duì)照品于100 mL容量瓶中，加乙腈－無(wú)水乙醇(80∶20)溶解定容，制成每1 mL含苦參堿0.05 mg的溶液，即得。

供試品溶液的制備:精密稱取10 mg干燥物甲醇超聲溶解，并定容于10 mL容量瓶中，即得。

測(cè)定法:分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定。

2.2 正交試驗(yàn)法提取苦參堿

2.2.1 苦參堿提取工藝條件的選擇［5］采用水煎煮法進(jìn)行提取，以用水量、提取時(shí)間和提取次數(shù)為3個(gè)因素，設(shè)計(jì)3個(gè)水平，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，篩選最佳工藝條件。因素水平表見表1。

表1 因素水平表

2.2.2 考察指標(biāo)的確定和測(cè)定 苦參堿為苦參的主要有效成分，將其作為考察指標(biāo)，同時(shí)結(jié)合浸膏收率優(yōu)選最佳工藝。分別稱取苦參藥材9份各100 g，按照L9(34)正交表2設(shè)計(jì)的條件進(jìn)行煎煮，合并煎煮液，濾過，濾液濃縮，置已恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，70℃減壓干燥至完全干燥后，稱重并計(jì)算浸膏收率(浸膏收率%=浸膏重量/樣品重量×100%)，結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2直觀分析可知，以浸膏收率為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，在所考察的影響因素中，重要性依次為C＞A＞B;以苦參堿含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，在所考察的影響因素中，重要性依次為A＞C＞B。得到最佳工藝條件A2B1C3。

以浸膏收率為指標(biāo)方差分析結(jié)果表明，以浸膏收率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，C因素具有顯著意義，A因素和B因素均無(wú)顯著意義(表3);以苦參堿含量為指標(biāo)方差分析結(jié)果表明，以苦參堿含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，A因素、B因素和C因素均無(wú)顯著意義。綜合考慮環(huán)保節(jié)能因素，確定最佳提取工藝條件為A2B1C3，即加8倍量水提取3次，每次提取2 h(表4)。

表3 以浸膏收率為指標(biāo)方差分析結(jié)果

表4 以苦參堿含量為指標(biāo)方差分析結(jié)果

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 稱取苦參藥材3份，按正交試驗(yàn)優(yōu)選的最佳提取工藝進(jìn)行放大驗(yàn)證試驗(yàn)，即加8倍量水提取3次，每次提取2 h。三次驗(yàn)證試驗(yàn)干膏收率(%)分別為 22.4、22.0、22.1，苦參總堿含量(%)分別為 6.08、5.94、5.87;干膏收率(%)和苦參總堿含量(%)的平均值分別為 22.2、5.94。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明正交設(shè)計(jì)篩選出的最佳提取工藝條件重現(xiàn)性良好，說明此工藝穩(wěn)定、可行。

2.3 苦參堿純化工藝的優(yōu)化 苦參提取之后，除有效成分外，還含有較多的淀粉等雜質(zhì)，而這些雜質(zhì)將影響其質(zhì)量，因此需要對(duì)粗提物進(jìn)行純化。本文采用乙醇沉淀及三氯甲烷萃取相結(jié)合的方法對(duì)苦參粗提物進(jìn)行純化。

2.3.1 乙醇沉淀 取苦參提取液濃縮成1.0、1.5、2.0 g生藥/mL，每份取相當(dāng)于生藥100 g，加乙醇使含醇量達(dá)75%，4℃冷藏，上清液回收乙醇，比較不同藥液濃度對(duì)收膏率及苦參堿含量的影響，結(jié)果見表5。

表5 不同藥液濃度對(duì)收膏率及苦參堿含量影響的比較

從表中可以看出，當(dāng)藥液濃度為1.0 g生藥/mL時(shí)，收膏率高，從苦參堿含量比較，當(dāng)藥液濃度為2.0 g生藥/mL時(shí)，苦參堿的含量較高，但是此時(shí)收率比較低。綜合考慮收膏率及苦參堿含量，選擇將藥液濃縮至1.0 g生藥/mL進(jìn)行醇沉。

2.3.2 三氯甲烷萃取 利用生物堿的堿性，將苦參提取液中生物堿加堿堿化，用三氯甲烷萃取，回收三氯甲烷，即可得到純度較高的生物堿。

取經(jīng)苦參醇沉并回收乙醇后的藥液3份，每份相當(dāng)于生藥 100 g，加水至1 mL∶1.5 g生藥，用20%氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至11，用三氯甲烷分別萃取1、2、3次，比較不同萃取次數(shù)對(duì)收膏率及苦參堿含量的影響，結(jié)果見表6。

表6 萃取次數(shù)的比較

從表中可以看出，萃取3次，收膏率高，從苦參堿含量比較，藥液萃取2次，苦參堿的含量較高，但此時(shí)收率相對(duì)較低。綜合考慮收膏率及苦參堿含量，選擇萃取3次。

2.3.3 pH的考察 取經(jīng)苦參醇沉并回收乙醇后的藥液3份，每份取相當(dāng)于生藥100 g，加水至1 mL∶1.5 g生藥，分別用20%氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至9、10、11，用三氯甲烷各萃取3次，比較不同pH值對(duì)收膏率及苦參堿含量的影響，結(jié)果見表7。

表7 不同pH值的比較

從表中可以看出，調(diào)整pH值至9～11，對(duì)收膏率及苦參堿含量影響不明顯。因此，萃取時(shí)調(diào)節(jié)藥液的pH值至9～11。

2.3.4 批驗(yàn)證試驗(yàn) 稱取苦參粗提物3份各1 kg，按照篩選出的最佳純化工藝進(jìn)行放大驗(yàn)證試驗(yàn)。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果無(wú)顯著性差異，說明該工藝穩(wěn)定、可行。

3 討論與小結(jié)

苦參粗提物被20%氫氧化鈉溶液堿化后，生物堿被游離出來(lái)，易被三氯甲烷等溶劑萃取，但生物堿還能與苦參粗提物中的淀粉等雜質(zhì)生成不溶或難溶沉淀，同時(shí)非堿溶性物質(zhì)也析出，形成咖啡色沉淀，包埋并帶走部分生物堿，造成生物堿的損失。所以采用乙醇沉淀及三氯甲烷萃取相結(jié)合的方法先除去苦參粗提物中的淀粉等雜質(zhì)。

苦參藥材用8倍量水提取3次，每次提取2 h，合并藥液并濃縮至1.0 g生藥/mL時(shí)進(jìn)行醇沉，醇沉后調(diào)節(jié)藥液的pH值為9～11，并用三氯甲烷萃取3次。優(yōu)選出的提取、純化工藝穩(wěn)定、可行，可用于苦參堿的工業(yè)化提取。

［1］劉 梅，劉雪英，程建峰.苦參堿的藥理研究進(jìn)展［J］.中國(guó)中藥雜志，2003，28(9):801－804.

［2］李 燕，何立人.苦參堿類生物堿的心血管系統(tǒng)藥理研究［J］.中草藥，2000，31(3):227－229.

［3］馬方勵(lì)，程 怡.苦參堿多種制劑的藥效學(xué)研究進(jìn)展［J］.中成藥，2004，26(5):420－422.

［4］中國(guó)獸藥典委員會(huì).《中華人民共和國(guó)獸藥典》二○一○年版二部［S］.

［5］鄧麗琴.苦參中苦參堿提取工藝研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2006，17(2):233－234.