Rac1對L02肝細(xì)胞株上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化及增殖和凋亡的影響*

王暉暉，張峰，沈珊珊，諸葛宇征

·實(shí)驗(yàn)性肝炎·

Rac1對L02肝細(xì)胞株上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化及增殖和凋亡的影響*

王暉暉，張峰，沈珊珊，諸葛宇征

目的檢測Rac1在TGF-β1誘導(dǎo)的L02細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用，及其對細(xì)胞增殖和凋亡的影響。方法應(yīng)用不同活性的Rac1質(zhì)粒pExRed-NLS Flag（空載體組）、pExRed-NLS Flag Rac1（野生型Rac1組）、pExRed-NLS Flag Rac1T17N（顯性負(fù)調(diào)控Rac1組）、pExRed-NLS Flag Rac1G12V（持續(xù)活化型Rac1組）瞬時轉(zhuǎn)染L02細(xì)胞，經(jīng)5 ng/ml TGF-β1處理細(xì)胞。采用免疫印跡法檢測融合蛋白Flag-Rac1表達(dá)，采用細(xì)胞免疫熒光及免疫印跡法檢測Ck8和Vimentin表達(dá)，采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell法檢測細(xì)胞遷移能力。使用不同濃度的Rac1特異性抑制劑NSC23766處理L02細(xì)胞，采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖，采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡。結(jié)果四組質(zhì)粒均成功瞬時轉(zhuǎn)染到L02細(xì)胞中；與空載體組和野生型Rac1組比，持續(xù)活化型Rac1轉(zhuǎn)染細(xì)胞Vimentin蛋白表達(dá)水平顯著增高，CK8蛋白表達(dá)水平降低，細(xì)胞遷移能力增加；與空載體組和野生型Rac1組比，顯性負(fù)調(diào)控Rac1轉(zhuǎn)染細(xì)胞Vimentin蛋白表達(dá)水平降低，CK8蛋白表達(dá)水平增高，細(xì)胞遷移能力降低（P＜0.05）；在NSC23766處理L02細(xì)胞后，細(xì)胞增殖被抑制，但各處理組細(xì)胞凋亡無明顯差異。結(jié)論Rac1可促進(jìn)TGF-β1誘導(dǎo)的L02肝細(xì)胞株上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和細(xì)胞增殖，但對細(xì)胞凋亡無明顯影響。

L02細(xì)胞；Rac1；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；增殖；凋亡

上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）是指具有極性的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化成具有活動能力、能夠在細(xì)胞基質(zhì)間自由移動的間質(zhì)細(xì)胞，以上皮細(xì)胞極性的喪失和間質(zhì)特性的獲得為重要特征[1]。近年來，已有研究發(fā)現(xiàn)肝上皮細(xì)胞可通過EMT參與細(xì)胞外基質(zhì)的合成與分泌[2]。Ras相關(guān)C3肉毒素底物1（Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，Rac1）是小G蛋白超家族的成員之一，于1989年首次被發(fā)現(xiàn)[3]。眾多研究顯示Rac1在多種細(xì)胞內(nèi)具有調(diào)節(jié)肌動蛋白細(xì)胞骨架重組，導(dǎo)致細(xì)胞板狀偽足形成和膜褶皺樣運(yùn)動，促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動與遷移，抑制細(xì)胞凋亡等作用[4]。Bakin et al[5]證實(shí)Rac1通過抑制轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）誘導(dǎo)鼠乳腺上皮細(xì)胞（NmuMG）中p38MAPK及其下游底物ATF2的磷酸化，進(jìn)而抑制TGF-β1誘導(dǎo)的EMT。TGF-β1在誘導(dǎo)肝細(xì)胞EMT中也起到關(guān)鍵的作用[6]。但是，Rac1在EMT中的作用尚不清楚。本文將通過轉(zhuǎn)染不同活性的Rac1質(zhì)粒到人肝上皮細(xì)胞株L02中，觀察其對TGF-β1誘導(dǎo)的EMT的作用，同時研究Rac1對L02細(xì)胞增殖和凋亡的影響，以進(jìn)一步探討Rac1在肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑人肝細(xì)胞株L02細(xì)胞為南京市鼓樓醫(yī)院消化科實(shí)驗(yàn)室保存;四種質(zhì)粒pExRed-NLS Flag（空載體）、pExRed-NLS Flag Rac1（野生型）、pExRed-NLS Flag Rac1T17N（顯性負(fù)調(diào)控）和pExRed-NLS Flag Rac1G12V（持續(xù)活化型）由日本心腦血管研究中心Nao Mochizuki教授惠贈，RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購于維森特生物技術(shù)（南京）有限公司；胰酶購于美國Gibco公司；CCK-8試劑盒購于日本同仁化學(xué)研究所；抗Rac1小鼠源性單克隆抗體購于英國Abcam公司，抗波形蛋白（Vimentin）鼠源性抗體購于德國Merck&Millipore公司;抗角蛋白-8（Cytokeratin-8，CK-8）兔源性抗體購于Bioworld公司；GAPDH購于美國Epitomics公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠或抗兔IgG購自杭州聯(lián)科生物公司；TGF-β1購自美國Peprotech公司，F(xiàn)ITC標(biāo)志的羊抗兔IgG和Lipofectamine2000購于美國Invitrogen公司；Transwell小室購自美國Corning公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購于圣地亞哥eBioscience公司；NSC23766購于美國Tocris bioscience公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)取人L02細(xì)胞，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中（37℃、5%CO2），待細(xì)胞融合至90%左右，用0.25%胰酶-EDTA消化、傳代。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及TGF-β1預(yù)處理將對數(shù)生長期的L02細(xì)胞以每孔2×105個細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃培養(yǎng)過夜。根據(jù)Lipofectamine2000說明書操作步驟，將四種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)染4～6 h，換成正常培養(yǎng)基，并用5 ng/ml TGF-β1處理48 h。

1.4 細(xì)胞融合蛋白的檢測采用Western blotting法，取經(jīng)過預(yù)處理的細(xì)胞，加PBS洗滌，加入RIPA裂解液冰上裂解30 min，30 min后4℃、12000 r/m離心10 min，取上清液于-20℃保存。各組蛋白等量加樣，10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，200 mA恒流轉(zhuǎn)至PDVF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入一抗（小鼠抗人Rac1 1:5000，兔抗人GAPDH 1:5000，小鼠抗人Vimentin 1:5000，兔抗人CK8 1:5000），室溫孵育過夜，TBST洗滌3次，加HRP標(biāo)記的羊抗兔或鼠（1:5000）二抗，室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10 min，加ECL發(fā)光液化學(xué)發(fā)光顯色，手動壓片曝光，并用Quantity one 4.4定量分析，以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH的比值作為目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.5 細(xì)胞Vimentin和CK8檢測采用免疫熒光法，取預(yù)處理細(xì)胞，加4%多聚甲醛固定15 min，加10%山羊血清封閉1 h，加小鼠抗人Vimentin單克隆抗體（1:200），兔抗人CK8單克隆抗體（1:200），4℃過夜，加FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG（1:200）室溫下孵育1 h，用2 μg/ml DAPI避光孵育5 min，染核。于熒光顯微鏡下拍照，并分析各組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。

1.6 細(xì)胞遷移能力檢測采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)法，轉(zhuǎn)染細(xì)胞4～6 h，以無菌移液管尖在培養(yǎng)板單層細(xì)胞的相同位置劃直線，PBS洗去脫落細(xì)胞，加5 ng/ml的TGF-β1處理24 h，顯微鏡下觀察細(xì)胞從劃痕處向中央爬行的距離，每孔隨機(jī)選取6個視野觀察并拍攝，行3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)取均值；另采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染細(xì)胞4～6 h，胰酶消化，調(diào)整各組細(xì)胞使其細(xì)胞數(shù)為1×104/ml。取各組細(xì)胞200 μl，加入各小室，下室加入500 μl的10%FBS-RPMI 1640培養(yǎng)基，并按5 ng/ml的質(zhì)量濃度加入TGF-β1，常規(guī)培養(yǎng)24 h，取出，加PBS洗滌，4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，光鏡下隨機(jī)選取6個視野，拍照、計(jì)數(shù)，取平均值。

1.7 細(xì)胞增殖的檢測采用CCK-8法，取對數(shù)生長期的L02細(xì)胞，以2×104/孔接種于96孔板，過夜貼壁培養(yǎng)，加入質(zhì)量濃度分別為25μmo/L、50μmo/L、100μmo/L和200μmo/L的Rac1特異性抑制劑NSC23766，分別處理0 h、24 h、48 h和72h。每組加入CCK-8溶液10μl/孔，37℃培養(yǎng)箱孵育1 h，以酶標(biāo)儀測定450 nm波長處吸光度值。

1.8 細(xì)胞凋亡的檢測采用Annexin V-FITC/PI雙染法，加不同濃度的NSC23766（25μmo/L、50μmo/L、100μmo/L和200μmo/L）干預(yù)L02細(xì)胞48 h，按照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書處理，上流式細(xì)胞儀（BD FACSAria II）檢測。1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染情況在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，采用Western blotting法檢測融合蛋白Flag-Rac1的表達(dá)，結(jié)果與空質(zhì)粒組比，野生型Rac1組、顯性負(fù)調(diào)控Rac1組和持續(xù)活化型Rac1組在瞬時轉(zhuǎn)染后，可見融合蛋白的表達(dá)（圖1）。

圖1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染L02細(xì)胞融合蛋白的表達(dá)1：pExRed-NLS Flag；2：pExRed-NLS Flag Rac1；3：pExRed-NLS Flag Rac1T17N；4：pExRed-NLS Flag Rac1G12V（持續(xù)活化型Rac1組）

2.2 Rac1促進(jìn)間質(zhì)Vimentin表達(dá)，抑制上皮CK8表達(dá)四組細(xì)胞在瞬時轉(zhuǎn)染后，與空質(zhì)粒組和野生型Rac1組比，持續(xù)激活型Rac1轉(zhuǎn)染細(xì)胞CK8表達(dá)減少，Vimentin表達(dá)增加，而顯性負(fù)調(diào)控Rac1轉(zhuǎn)染細(xì)胞CK8表達(dá)增加，Vimentin表達(dá)減少（圖2）；持續(xù)激活型Rac1轉(zhuǎn)染細(xì)胞較空質(zhì)?；蛞吧蚏ac1轉(zhuǎn)染細(xì)胞CK8表達(dá)減少，Vimentin表達(dá)增加，而顯性負(fù)調(diào)控Rac1轉(zhuǎn)染細(xì)胞CK8表達(dá)增加，Vimentin表達(dá)減少，以上差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05，圖3）。

2.3 Rac1促進(jìn)L02細(xì)胞遷移與空質(zhì)?；蛞吧蚏ac1轉(zhuǎn)染細(xì)胞比，持續(xù)激活型Rac1轉(zhuǎn)染細(xì)胞劃痕愈合效率較高，而顯性負(fù)調(diào)控Rac1轉(zhuǎn)染細(xì)胞則相對較低（P均＜0.05，圖4）；與空質(zhì)?；蛞吧蚏ac1轉(zhuǎn)染細(xì)胞比，持續(xù)激活型Rac1轉(zhuǎn)染的L02細(xì)胞遷移能力增加，而顯性負(fù)調(diào)控Rac1轉(zhuǎn)染的L02細(xì)胞遷移能力減弱（P均＜0.05，圖4）。

圖2 各組細(xì)胞Vimentin和CK8的表達(dá)情況（免疫熒光染色，400×）

圖3 各組細(xì)胞Vimentin和CK8的表達(dá)情況（Western blotting法）

圖4 各組細(xì)胞遷移能力的變化細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell法檢測

2.4 Rac1促進(jìn)L02細(xì)胞增殖與對照組比，除了25 μmo/L處理組的細(xì)胞外，其他處理組的L02細(xì)胞在48 h和72 h時的細(xì)胞增殖率均降低，且呈濃度依賴性（圖5）。

圖5 NSC23766對細(xì)胞增殖的影響

2.5 Rac1對L02細(xì)胞凋亡無影響與對照組比，各處理組L02細(xì)胞凋亡的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖6）。

圖6 NSC23766對細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

在誘導(dǎo)EMT發(fā)生的眾多細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子中，TGF-β1是關(guān)鍵因子之一。TGF-β1首先被發(fā)現(xiàn)在正常乳腺上皮細(xì)胞中可誘導(dǎo)EMT的發(fā)生[4]，之后又被證明其能在體外調(diào)控多種不同的上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，包括角質(zhì)形成細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞等[6，8]。Kojima et al[9]研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1通過下調(diào)Claudin-1，同時上調(diào)SIP1和Snail誘導(dǎo)大鼠肝細(xì)胞EMT。Kaimori et al[10]進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，組蛋白脫乙酰酶可抑制TFG-β1誘導(dǎo)肝細(xì)胞EMT的發(fā)生。

已有研究表明Rac1可通過不同機(jī)制參與多種上皮細(xì)胞的EMT過程，Rac1可協(xié)同PI3K、JNK信號通路，在I型膠原誘導(dǎo)的鼠乳腺上皮細(xì)胞的EMT過程中發(fā)揮調(diào)控作用。Santibanez et al發(fā)現(xiàn)表達(dá)持續(xù)活化型Rac1（Q61LRac1）可促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞發(fā)生EMT，同時細(xì)胞運(yùn)動及侵襲能力增強(qiáng)。相反，表達(dá)顯性負(fù)調(diào)控型Rac1（N17TRac1）將抑制TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞伸展、運(yùn)動和遷移。然而，在TGF-β1誘導(dǎo)的肝上皮細(xì)胞EMT中Rac1的作用并不明確。

本實(shí)驗(yàn)通過將不同Rac1活性的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到肝上皮細(xì)胞中，經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)后，證實(shí)Rac1通過以下兩個方面影響L02細(xì)胞EMT：（1）細(xì)胞出現(xiàn)EMT分子標(biāo)志物的改變，即上皮標(biāo)志物CK8表達(dá)下調(diào)、間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin表達(dá)上調(diào)；（2）細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Tranwell小室實(shí)驗(yàn)均證實(shí)細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)。

既往研究主要集中在Rac1對細(xì)胞運(yùn)動等的影響，而并無Rac1對肝上皮細(xì)胞的增殖和凋亡影響的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)中采用的特異性Rac1抑制劑NSC23766是一種具有膜通透性的復(fù)合物，能特異性地阻斷Rac1與Rac1特異性的GEFs Trio和Tiam1結(jié)合而影響Rac1 GDP/GTP的循環(huán)，從而抑制Rac1的活性。本研究用CCK-8法檢測了不同濃度Rac1抑制劑NSC23766對L02增殖水平的影響，結(jié)果顯示L02細(xì)胞增殖被抑制的程度隨著抑制劑濃度的增加而增加，即抑制Rac1的活性可抑制L02細(xì)胞增殖，與Bosco et al的研究結(jié)果相吻合，即在抑制Rac1活性后，經(jīng)典Wnt通路受抑制，從而逆轉(zhuǎn)了缺乏NF2細(xì)胞的細(xì)胞增殖。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)不同濃度的NSC23766對L02細(xì)胞凋亡無明顯的影響。

本研究通過將上調(diào)和下調(diào)Rac1活性的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到L02細(xì)胞，初步證實(shí)Rac1可促進(jìn)TGF-β1誘導(dǎo)的肝上皮細(xì)胞EMT；通過Rac1抑制劑處理L02細(xì)胞，觀察到Rac1可促進(jìn)L02細(xì)胞增殖，而對其凋亡無明顯影響；這些現(xiàn)象的發(fā)生機(jī)制仍然有待進(jìn)一步探討。

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（收稿：2014-02-07）

（校對：陳從新）

Effects of Rac1 on epithelial-mesenchymal transition，and proliferation and apoptosis of L02 cells in vitro

Wang Huihui，Zhang Feng，Shen Shanshan，et al.School of Medicine，Southeast University，Nanjing，210009，Jiangsu Province，China

ObjectiveTo investigate the effects of Rac1 on epithelial mesenchymal transition（EMT）induced by transforming growth factor β1（TGF-β1），and on cell proliferation and apoptosis of L02 cells in vitro. MethodsRac1 plasmids with different activity including pExRed-NLS Flag（vector），pExRed-NLS Flag Rac1（wild type），pExRed-NLS Flag Rac1T17N（dominant negative mutant）and pExRed-NLS Flag Rac1G12V（constitutively active mutant）were transiently transfected into L02 cells，followed by stimulation of exogenous TGF-β1 at dose of 5ng/ml；Exogenous Flag-Rac1 fusion protein was determined by Western blot analysis；Immunofluorescence and Western blot were used to evaluate epithelial markers of Ck8 and mesenchymal markers of vimentin；Cell motility was assessed by transwell assay and wound healing assay；L02 cells were treated with different concentrations of Rac1 inhibitor（NSC23766），and the influence of Rac1 on cell proliferation and apoptosis were detected by CCK-8 assay or Annexin V-FITC/PI double staining，respectively.ResultAll kinds of plasmids were successfully transiently transfected into L02 cells；Compared with the vector group and the wild type group，constitutively active mutant pExRed-NLS Flag Rac1G12V significantly increased the expression of vimentin，decreased the expression of CK8 and enhanced cell motility，whereas the effects of dominant negative mutant pExRed-NLS Flag Rac1T17N were just the opposite of above results（P＜0.05）；Disruption of Rac1 activity with NSC23766 inhibited cell proliferation（P＜0.05）without increasing cell apoptosis.ConclusionsRac1 promotes the EMT process and cell proliferation induced by TGF-β1 in L02 cells without affecting cell apoptosis in vitro.

L02 cells；Rac1；Epithelial-mesenchymal transition；Proliferation；Apoptosis

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.05.019

江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（BK2011094）

210009南京市東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院（王暉暉）；南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院消化科(張峰,沈珊珊，諸葛宇征)

王暉暉，女，24歲，碩士研究生。E-mail: wanghuihui19891021@163.com

諸葛宇征，E-mail：yuzheng9111963@aliyun.com