術(shù)前血清miR-221水平對肝細胞肝癌R0切除術(shù)后早期復(fù)發(fā)的預(yù)測價值*

郭曉東，余靈祥，李瑞生，周艷賢，郭超楠，楊美

·短篇論著·

術(shù)前血清miR-221水平對肝細胞肝癌R0切除術(shù)后早期復(fù)發(fā)的預(yù)測價值*

郭曉東，余靈祥，李瑞生，周艷賢，郭超楠，楊美

目的探討肝細胞癌（HCC）患者術(shù)前血清miR-221水平與R0切除術(shù)后患者生存和早期復(fù)發(fā)的關(guān)系。方法選取2009年7月至2011年8月在我院行R0切除術(shù)治療的78例HCC患者，采用實時熒光定量RT-PCR法檢測血清miR-221水平，并分析血清miR-221水平與HCC患者臨床和病理特征的關(guān)系。結(jié)果38例高分化HCC患者血清miR-221水平為（6.4±2.2），而39例低分化患者為[（11.5±4.3），P＜0.05]，13例血清AFP＜20μg/L患者血清miR-221水平為（5.9±3.6），而65例血清AFP＞20μg/L患者為[（9.6±2.9），P＜0.05]，而在不同性別、年齡、肝硬化有無、腫瘤大小、Child-Pugh分級間無明顯差異（P＞0.05）；78例HCC患者在R0切除術(shù)后血清miR-221相對水平（3.49±0.73）較術(shù)前（8.95±1.57）顯著降低（P＜0.05）；高水平組1 a生存率為45.3%（24/53），低水平組為72.0%（18/25，P＜0.05）；高水平組平均疾病進展時間（TTP）和中位生存期（MOS）分別為10.7個月和14.2個月，而低水平組則分別為15.3個月和19.2個月，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論血清miR-221水平與HCC患者臨床和病理特征密切相關(guān)，其術(shù)前血清高水平提示HCC患者在R0切除術(shù)后仍預(yù)后不良。

肝細胞癌；肝切除術(shù)；miR-221；預(yù)后

Hepatocellular carcinoma；Hepatectomy；miR-221；Prognosis

肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是目前世界上最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，每年全球大約有70萬人死于HCC[1]。手術(shù)切除腫瘤仍然是目前最有效的治療手段。R0指在顯微鏡下切緣無癌細胞的完整腫瘤切除，即所謂的根治性切除，理論上獲得R0切除的患者可以獲得較長的生存期。但由于術(shù)前或術(shù)中可能存在肝癌細胞的微轉(zhuǎn)移等原因可導(dǎo)致術(shù)后早期腫瘤復(fù)發(fā)[2]。“理想”的HCC標志物有利于我們有效評估手術(shù)切除效果，以及判斷術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。目前，臨床上最常用的用于HCC復(fù)發(fā)和預(yù)后的血清學(xué)標志物甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP）存在一定的假陽性或假陰性的情況[3]。因此，尋找一種在敏感性和特異性方面都令人滿意的反映HCC預(yù)后的標志物仍是目前研究的重點和熱點。miRNA是新近發(fā)現(xiàn)的一類在真核生物中廣泛存在的非編碼調(diào)控單鏈小分子RNA。最新的研究顯示，血液循環(huán)中腫瘤相關(guān)miRNAs還能作為惡性腫瘤診斷的生物學(xué)標志物[4]。miR-221是目前已知的在HCC患者癌組織中高表達的miRNA，且能在血清中檢測到，與HCC的發(fā)生和預(yù)后密切相關(guān)[5]。本研究通過檢測HCC患者在R0切除術(shù)后血清miR-221水平的變化，以探討其與患者生存和早期復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 病例來源選取2010年7月至2012年8月在我院行R0切除術(shù)治療的78例HCC患者，所有患者均經(jīng)組織病理學(xué)檢查證實為HCC。其中男性61例，女性17例；年齡42～67歲，平均年齡（48.7±7.2）歲。術(shù)前AFP＞20 μg/L者65例，AFP≤20 μg/L者13例。所有患者均獲得完整隨訪，且未在術(shù)后30 d內(nèi)死亡。患者納入標準：①病灶數(shù)≤3個，腫瘤最大直徑≤10 cm；②腫瘤包膜或假包膜完整；③無肉眼可見的血管癌栓和區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；④無遠處轉(zhuǎn)移；⑤肝功能Child-Pugh A級或B級；⑥術(shù)中經(jīng)超聲檢查證實剩余肝無殘留腫瘤，且病理學(xué)檢查證實手術(shù)切緣無腫瘤細胞殘留。本研究獲得患者及其家屬簽署知情同意書，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過。

1.2 血清miR-221水平檢測應(yīng)用RT-PCR法，所有患者均在R0切除術(shù)前1～3 d及術(shù)后1個月空腹采集靜脈血5 ml，置于含有促凝劑和明膠的試管中，置于室溫下1 h。然后，在3000 r/m條件下離心15 min，將上層血清轉(zhuǎn)移至潔凈的EP管中，置于-80℃冰箱待測；根據(jù)mirVana PARIS Kit（AMl 556）提取試劑盒提供的方法提取血清RNA。采用NanoDropTM測定RNA水平并評估純度，選取OD260/OD280值在1.9～2.1之間的樣本進行下一步實驗。選取U6作為內(nèi)參基因，建立15 μl反轉(zhuǎn)錄體系：即dNTP 0.15 μl，Multiscribe RT enzyme 1 μl，Buffer 1.5 μl，RNase Inhibitor 0.19 μl，Nuclease free water 4.16 μl，RT Primer 3 μl，RNA 5 μl。在Gene Amp PCR System 9700上進行RT反應(yīng)：16℃，30 min；42℃，30 min；85℃，5 min，在反應(yīng)結(jié)束后，冰上冷卻5 min，-20℃保存。Realtime PCR反應(yīng)：以U6為內(nèi)參基因，建立20 μl反應(yīng)體系：即TaqMan miRNA Assay 1 μl，Product from RT reaction 2 μl，TaqMan 2×Universal PCR Master Mix 10 μl，Nuclease free water 7 μl。反應(yīng)條件設(shè)置為：95℃，3 min；再95℃，15 s；60℃，30 s；72℃，30 s，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCT法分析miR-221水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料采用（±s）表示，各組間數(shù)據(jù)差異分析采用配對t檢驗，采用Kaplan-Meire法計算TTP和OS，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC患者不同臨床和病理學(xué)因素情況下血清miR-221水平比較經(jīng)RT-PCR擴增，曲線為典型的“S”型，其融解曲線成單峰，表明擴增產(chǎn)物單一。將PCR擴增后的終產(chǎn)物進行凝膠電泳，結(jié)果顯示為單一清晰的條帶，大小和設(shè)計片段相同，證實為特異性擴增。RT-PCR結(jié)果顯示，HCC患者血清miR-221水平在不同AFP水平和腫瘤分化程度方面存在顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），而在不同性別、年齡、肝硬化有無、腫瘤大小、Child-Pugh分級間無明顯差異（P＞0.05，表1）。

表1 HCC患者術(shù)前血清miR-221水平分層分析

2.2 R0切除術(shù)前后HCC患者血清miR-221水平變化HCC患者在R0切除術(shù)前血清miR-221水平的相對值為（8.95± 1.57），在R0切除術(shù)后1 m，HCC患者血清miR-221水平的相對值為（3.49±0.73），較術(shù)前明顯降低（P＜0.05）。

2.3 R0切除術(shù)前血清miR-221水平與患者預(yù)后的關(guān)系術(shù)后隨訪患者至2013年10月，平均隨訪（23.7±7.4）個月，中位隨訪時間為21個月。按術(shù)前HCC患者血清miR-221水平分組，將78例HCC患者分為miR-221高水平組53例和低水平組25例。至隨訪截止時，高水平組1 a生存率為45.3%（24/53），低水平組為72.0%（18/25，P＜0.05）；高水平組平均疾病進展時間（TTP）和中位生存期（MOS）分別為10.7個月和14.2個月，而低水平組則分別為15.3個月和19.2個月，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

由于患者在術(shù)前或者術(shù)中可能有腫瘤細胞通過血液和/或淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移至遠處組織器官而成為術(shù)后復(fù)發(fā)的根源，因而即使是R0切除，術(shù)后也存在早期腫瘤復(fù)發(fā)的問題。如果能在早期發(fā)現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)并及時采取治療，可以延長患者的生存時間，改善預(yù)后[6]。AFP是最常用的預(yù)測HCC術(shù)后復(fù)發(fā)的指標。研究顯示[7]，血清AFP＞20 μg/L是HCC根治性切除術(shù)后早期復(fù)發(fā)的風(fēng)險因素之一。然而，大量的臨床數(shù)據(jù)顯示，HCC患者血清AFP水平不盡相同，甚至存在AFP陰性的HCC患者[8]。此外，肝炎、肝硬化、生殖細胞腫瘤、胰腺癌或肺癌等患者亦可出現(xiàn)不同程度的AFP升高。因此，單純依靠AFP不利于HCC的早期診斷和判斷術(shù)后早期復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移[9]。

miRNA是一類長度為20～25 nt，不編碼蛋白質(zhì)的單鏈小RNA。miRNA能夠與靶基因mRNA的3'-UTR（untranslated region）區(qū)的堿基互補配對，使其降解或抑制其表達，從而導(dǎo)致特定基因的沉默，進而參與機體各種重要的生理和病理過程。最近的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在腫瘤的早期診斷和治療等方面表現(xiàn)出良好的潛能。血清腫瘤相關(guān)miRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移以及預(yù)后密切相關(guān)[10]。miR-221是新近發(fā)現(xiàn)的一個腫瘤相關(guān)miRNA，其在肝癌、胰腺癌、乳腺癌、胃癌、膠質(zhì)母細胞瘤、卵巢癌、黑色素瘤等多種惡性腫瘤中表達均明顯上調(diào)[11～13]，其致癌機理可能通過抑制細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子的表達，來調(diào)節(jié)細胞周期和增殖能力，抑制細胞分化和凋亡，從而促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[14～15]。

本研究將HCC患者血清miR-221水平與HCC臨床和病理因素之間的關(guān)系進行比較分析發(fā)現(xiàn)，HCC患者血清miR-221水平在AFP和腫瘤分化程度方面差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示血清miR-221與HCC的發(fā)生和腫瘤惡性程度存在一定的關(guān)聯(lián)，這與前面相關(guān)文獻的報道是一致的，也間接驗證了miR-221具有抑制腫瘤細胞分化的能力。

HCC患者術(shù)后早期復(fù)發(fā)的預(yù)測對于提高HCC患者手術(shù)治療效果有著至關(guān)重要的意義。我們將術(shù)前HCC患者分成miR-221高水平組和低水平組，通過隨訪發(fā)現(xiàn)，術(shù)前血清miR-221高水平提示較高的早期復(fù)發(fā)可能，且其平均疾病進展時間和中位生存期也明顯低于低水平組，提示血清miR-221水平在判斷HCC預(yù)后上有一定的意義。因此，對于術(shù)前血清miR-221高水平患者，術(shù)后應(yīng)積極進行系統(tǒng)治療，并嚴格監(jiān)測腫瘤的復(fù)發(fā)情況，及早發(fā)現(xiàn)并進行必要的處理。

[1]Block T，Mehta A S，London W T.Hepatocellular carcinoma of the liver.Cancer Biomark，2010，9（1-6）:375-383.

[2]吳力群，王祖森，胡維昱，等.528例原發(fā)性肝細胞癌患者肝切除術(shù)后1年生存分析.中華普通外科雜志，2012，27（2）:92-95.

[3]王紅陽.肝癌診斷與預(yù)后判斷的分子標志物.中華肝臟病雜志, 2011，19（4）:241-243.

[4]JuJ，JiangJ，F(xiàn)eslerA.miRNA:thenewfrontierincancer medicine.Future Med Chem，2013，5（9）:983-985.

[5]Li J，Wang Y，Yu W，et al.Expression of serum miR-221 in human hepatocellular carcinoma and its prognostic significance. Biochem Biophys Res Commun，2011，406（1）:70-73.

[6]吳育連，蘇昆侖，董鑫，等.肝癌切除術(shù)后早/晚期復(fù)發(fā)的危險因素與治療.中華肝膽外科雜志，2006，12（6）:370-373.

[7]Moriguchi M，Takayama T，Higaki T，et al.Early cancer-related deathafterresectionofhepatocellularcarcinoma.Surgery，2012，151（2）:232-237.

[8]王潔，孟運運，汪茂榮.血清AFP，GGT-Ⅱ和GGT聯(lián)合檢測診斷原發(fā)性肝癌的價值探討.實用肝臟病雜志，2012，15（6）: 545-547.

[9]王壽明，高蕾，于樂成，等.甲胎蛋白異質(zhì)體對肝癌診斷及療效評估價值研究進展.實用肝臟病雜志，2011，14（6）:479-481.

[10]Mitchell PS，Parkin RK，Kroh EM，et al.Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection.Proc Natl Acad Sci U S A，2008，105（30）:10513-10518.

[11]Pineau P，Volinia S，Mcjunkin K，et al.miR-221 overexpression contributes to liver tumorigenesis.Proc Natl Acad Sci U S A，2010，107（1）:264-269.

[12]DiLeva G，GaspariniP，PiovanC，etal.MicroRNAcluster 221-222andestrogenreceptoralphainteractionsinbreast cancer.J Natl Cancer Inst，2010，102（10）:706-721.

[13]Kawaguchi T，Komatsu S，Ichikawa D，et al.Clinical impact of circulatingmiR-221inplasmaofpatientswithpancreatic cancer.Br J Cancer，2013，108（2）:361-369.

[14]le Sage C，Nagel R，Egan D A，et al.Regulation of the p27（Kip1）tumor suppressor by miR-221 and miR-222 promotes cancer cell proliferation.EMBO J，2007，26（15）:3699-3708.

[15]雷永紅，呂文平，王海，等.肝細胞癌患者血清miR-221和miR-122的檢測及其臨床意義.河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2013，34（5）:522-525.

（收稿：2013-12-30）

（校對：陳宗炳）

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.05.028

國家“十二五”重大專項（2012ZX10002003-004-006）

100039北京市解放軍第三〇二醫(yī)院

郭曉東，男，32歲，醫(yī)學(xué)碩士，主治醫(yī)師。主要從事肝病診斷與治療工作。E-mail:guoxd_1981@163.com

Serum miR-221 levels predicts short-term survival after R0 resection in patients with hepatocellular carcinomaGuo Xiaodong，Yu Lingxiang，Li Ruisheng，et al.302nd Hospital，Beijing 100039