轉(zhuǎn)移因子膠囊中多肽與核糖含量測定方法研究

周天瓊，俞保彬，倪燕紅，周一峰，毛建衛(wèi)

（1.杭州華津藥業(yè)股份有限公司，杭州 310013；2.浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，杭州 310023；3.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310023）

轉(zhuǎn)移因子膠囊中多肽與核糖含量測定方法研究

周天瓊1，俞保彬1，倪燕紅1，周一峰2，3，毛建衛(wèi)2，3

（1.杭州華津藥業(yè)股份有限公司，杭州 310013；2.浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，杭州 310023；3.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310023）

研究了轉(zhuǎn)移因子膠囊的多肽與核糖含量測定方法。分別對福林酚法和紫外-可見分光光度法測定轉(zhuǎn)移因子膠囊多肽和核糖含量的方法進(jìn)行了考察。福林酚法對牛血清白蛋白在30～300μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.999 0），平均加樣回收率為99.77%，RSD為1.31%；紫外-可見分光光度法對D-核糖2～10μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.999 7），平均加樣回收率99.99%，RSD為1.02%。以上分析方法簡便、快速、準(zhǔn)確，可作為轉(zhuǎn)移因子膠囊多肽與核糖含量分析的方法。

轉(zhuǎn)移因子膠囊；多肽；核糖；含量測定

轉(zhuǎn)移因子（transfer factor，TF）是T淋巴細(xì)胞釋放的一種能夠轉(zhuǎn)移致敏信息的物質(zhì)，它能夠特異地將供體的細(xì)胞免疫信息轉(zhuǎn)移給受體，從而增強(qiáng)受體的免疫功能。轉(zhuǎn)移因子為具有生物活性的非均一性的小分子混合物，其內(nèi)含物包括游離氨基酸（16～18種）、核酸、多肽，以及K、Na、Ca、Mg、Zn等金屬元素[1]。轉(zhuǎn)移因子是小分子物質(zhì)，不會(huì)被胃蛋白酶、胰蛋白酶分解，也不會(huì)被胃酸破壞，可口服，無抗原性，無毒副作用和種屬差異性，是一種新型而又安全的免疫制劑[2]。轉(zhuǎn)移因子膠囊中的主要有效成分為多肽和核苷酸（以D-核糖計(jì)），可特異或非特異性地調(diào)節(jié)機(jī)體免疫狀態(tài)、增強(qiáng)其細(xì)胞免疫和骨髓造血功能。本研究對轉(zhuǎn)移因子膠囊的多肽與核糖含量測定方法進(jìn)行了探討。

1 儀器與試藥

紫外-可見分光光度計(jì)（TU-1800SPC）。牛血清白蛋白對照品、D-核糖對照品（中國食品藥品檢定研究院）；轉(zhuǎn)移因子膠囊（對照藥：南京瑞爾醫(yī)藥有限公司，批號為20101101；自制供試樣品：批號為110301、110302、110303）；碳酸鈉、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、硫酸銅均為分析純；福林酚試液按中國藥典2010年版二部附錄XV B[3]配制；水為純化水。

2 轉(zhuǎn)移因子膠囊中多肽含量測定方法研究

2.1 對照品溶液的制備

取牛血清白蛋白對照品，用水制成1 mL中含0.292 mg的溶液，即得。

2.2 線性關(guān)系考察

精密量取上述對照品溶液0.0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mL，分別置具塞試管中，各加水至1.0 mL，再分別加入堿性銅試液（取氫氧化鈉10 g，碳酸鈉50 g，加水400 mL使其溶解，作為甲液；取酒石酸鉀0.5 g，加水50 mL使其溶解，另取硫酸銅0.25 g，加水30 mL使其溶解，將兩液混合作為乙液。臨用前，合并甲、乙兩液，并加水至500 mL）1.0 mL，混勻，各加入福林酚試液[3]（取福林試液中的儲(chǔ)備液1→16）4.0 mL，立即搖勻，置55℃水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5 min，置冷水浴中10 min，以相應(yīng)的試劑為空白，在650 nm的波長處測定吸光度，結(jié)果見表1。以吸光度A為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度值c為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程得A=0.003 2c+0.057 5（r=0.999 0）。結(jié)果表明，牛血清白蛋白在30～300μg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

表1 牛血清白蛋白含量測定線性關(guān)系考察試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Experimetal results for investigation of linear relationship of content determination for bovine serum albumin

2.3 專屬性試驗(yàn)

為考察轉(zhuǎn)移因子膠囊所用輔料對多肽含量測定的影響，制備了不含轉(zhuǎn)移因子的空白輔料膠囊，按照2.2方法進(jìn)行測定，結(jié)果未檢出多肽，說明所用輔料對多肽含量測定無影響。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取轉(zhuǎn)移因子膠囊（批號：110301）內(nèi)容物適量，加水溶解后稀釋制成150μg/mL的溶液，過濾；精密量取濾液1.0 mL，按照2.2方法進(jìn)行試驗(yàn)，每隔0.5 h測定吸光度，試驗(yàn)數(shù)據(jù)見表2。結(jié)果顯示，供試品溶液在3 h內(nèi)穩(wěn)定。

表2 轉(zhuǎn)移因子膠囊中多肽分析的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Stability experimental results of polypeptide in transfer factor capsules

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

分別取供試品（批號：110301）內(nèi)容物適量，加水溶解后稀釋制成120、150、180μg/mL的溶液，過濾，精密量取濾液1.0 mL，按2.2方法分別重復(fù)測定6次，各質(zhì)量濃度項(xiàng)下的RSD均小于2%，試驗(yàn)測定重復(fù)性好（表3）。

表3 轉(zhuǎn)移因子膠囊中多肽分析的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 3 Repeatability experimental results of polypeptide in transfer factor capsules（n=6）

2.6 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取供試品（批號：110301）內(nèi)容物適量，加水溶解后稀釋制成250μg/mL的供試品溶液；取牛血清白蛋白對照品適量，加水制成250μg/mL的對照品溶液；分別取供試品溶液和對照品溶液24、30、36 mL，混勻，加水稀釋至100 mL，得多肽120、150、180μg/mL的溶液，按照2.2方法測定其多肽含量，計(jì)算平均回收率：

結(jié)果顯示，平均回收率為99.77%，RSD 1.31%。試驗(yàn)數(shù)據(jù)見表4。

表4 轉(zhuǎn)移因子膠囊中多肽分析的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Table 4 Recovery experimental results of polypeptide in transfer factor capsules（n=9）

2.7 各批樣品多肽含量測定

取轉(zhuǎn)移因子膠囊對照品和供試品內(nèi)容物適量（約相當(dāng)于多肽15 mg），精密稱定，置100 mL量瓶中，加水適量，振搖使其溶解，加水稀釋至刻度，搖勻，過濾，取濾液作為供試品溶液。精密量取供試品溶液1.0 mL，按照2.2方法測定，由回歸方程計(jì)算多肽含量，結(jié)果見表5。結(jié)果表明，各個(gè)供試樣品的多肽含量均在標(biāo)示量的90.0%～130.0%范圍內(nèi)，符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。

表5 轉(zhuǎn)移因子膠囊多肽含量測定結(jié)果Table 5 Determination results of polypeptide in transfer factor capsules

3 轉(zhuǎn)移因子膠囊中核糖含量測定方法研究

3.1 對照品溶液的制備

精密稱取D-核糖對照品適量，用5%三氯醋酸溶液溶解并制成20μg/mL的溶液，搖勻。

3.2 線性關(guān)系考察

精密量取對照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分別置具塞試管中，各加入5%三氯醋酸溶液適量至2.0 mL，各加入1%的3，5-二羥基甲苯溶液2.0 mL，搖勻，置沸水浴中準(zhǔn)確加熱30 min，迅速冷卻至室溫，以相應(yīng)的試劑為空白，在650 nm的波長處測定吸光度，結(jié)果如表6所示。以吸光度A為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度值c為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程A=0.067 4c-0.025 2（r=0.999 7）。結(jié)果表明，D-核糖在2～10μg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

3.3 專屬性試驗(yàn)

為考察轉(zhuǎn)移因子膠囊所用輔料對核糖含量測定的影響，制備了不含轉(zhuǎn)移因子的空白輔料膠囊，按照3.2 方法進(jìn)行含量測定，結(jié)果未檢出核糖，說明所用輔料對核糖含量測定無影響。

表6 D-核糖線性關(guān)系考察試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Experimental results for investigation of linear relationship of D-ribose

3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品（批號：110301）內(nèi)容物適量，加5%三氯醋酸溶液依法制成5μg/mL的供試品溶液，按照3.2進(jìn)行核糖含量測定，每隔0.5 h測定吸光度A，數(shù)據(jù)見表7。結(jié)果顯示，供試品溶液在3 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取供試品（批號：110301）內(nèi)容物適量，加5%三氯醋酸溶液依法制成4、5、6μg/mL的供試品溶液，按照3.2方法分別重復(fù)測定6次，數(shù)據(jù)見表8。結(jié)果表明，該法測定核糖含量重復(fù)性良好。

表7 轉(zhuǎn)移因子膠囊中核糖分析的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 7 Stability experimental results of ribose in transfer factor capsules

表8 轉(zhuǎn)移因子膠囊中核糖分析的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 8 Repeatability experimental results of ribose in transfer factor capsules

3.6 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取供試品（批號：110301）內(nèi)容物適量，加5%三氯醋酸溶液依法制成20μg/mL的樣品溶液，取D-核糖對照品溶液（20μg/mL），與樣品溶液按照1∶1比例制成含核糖量分別為4、5、6μg/mL的供試品溶液，按照3.2方法測定其核糖含量，計(jì)算核糖回收率，數(shù)據(jù)見表9。結(jié)果顯示平均回收率為99.99%，RSD 1.02%。

表9 轉(zhuǎn)移因子膠囊中核糖分析的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Table 9 Recovery experimental results of ribose in transfer factor capsules（n=9）

3.7 各批次樣品核糖含量測定

取轉(zhuǎn)移因子膠囊對照藥和供試品的內(nèi)容物適量進(jìn)行精密稱定，用5%三氯醋酸溶液制成5μg/mL的溶液，過濾，取濾液作為供試品溶液。精密量取供試品溶液2.0 mL，按照3.2 方法測定，由回歸方程求出核糖含量結(jié)果見表10。結(jié)果表明，各個(gè)供試樣品的核糖含量均高于標(biāo)示量的80%，符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。

4 結(jié) 語

表10 轉(zhuǎn)移因子膠囊中核糖含量測定結(jié)果Table 10 Determination results of ribose in transfer factor capsules

轉(zhuǎn)移因子膠囊主要成分為從健康豬脾臟中提取的多肽、氨基酸和多核苷酸等。臨床可用于輔助治療抗生素難以控制的病毒性或霉菌性細(xì)胞內(nèi)感染，如帶狀皰疹、流行性乙型腦炎、白色念珠菌感染和病毒性心肌炎等；對惡性腫瘤可作為輔助治療劑；對免疫缺陷病，如濕疹、血小板減少、多次感染綜合癥及慢性皮膚黏膜真菌病，有一定的療效[4-5]。

已有報(bào)道表明，轉(zhuǎn)移因子類產(chǎn)品多肽和核糖含量測定常受到如試劑、制劑輔料等多種因素的影響[6-7]。本研究對福林酚法和紫外-可見分光光度法測定轉(zhuǎn)移因子膠囊中多肽和核糖含量的方法進(jìn)行了考察，試驗(yàn)結(jié)果顯示，以上方法簡便、快速、準(zhǔn)確，具有重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高的優(yōu)點(diǎn)，適用于轉(zhuǎn)移因子膠囊中多肽和核糖含量的測定。

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[2] 郭成留，程會(huì)昌.動(dòng)物轉(zhuǎn)移因子及其研究進(jìn)展[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003（6）：46-48.

[3] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：二部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

[4] 任建平.轉(zhuǎn)移因子膠囊聯(lián)合阿德福韋酯對慢性乙型肝炎患者肝功能及血清細(xì)胞因子的影響[J].醫(yī)學(xué)綜述，2013，19（7）：1337-1338.

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[7] 蔣微琴，許曉燕，黃巖山，等.甘露醇對轉(zhuǎn)移因子口服凍干粉制劑中多肽含量測定的影響[J].科技通報(bào)，2008，24（6）：827-831.

Research on determination for polypeptide and ribose in transfer factor capsules

ZHOU Tianqiong1，YU Baobin1，NI Yanhong1，ZHOU Yifeng2，3，MAO Jianwei2，3
（1.Hangzhou Huajin Pharmaceutical Co.，Ltd.，Hangzhou 310013，China；2.School of Biological and Chemical Engineering，Zhejiang University of Science and Technology，Hangzhou 310023，China；3.Zhejiang Provincial Key Laboratory for Chemical and Biological Processing Technology of Farm Produce，Hangzhou 310023，China）

The analytical methods for polypeptide and ribose in transfer factor capsule were studied.The feasibility of Folin phenol method and UV-vis spectrophotometry method for polypeptide and ribose were investigated.The linear range of bovine serum albumin is 30-300 μg/m L（r=0.999 0），and the average recovery of bovine serum albumin is 99.77%（RSD 1.31%）.The linear range of D-ribose is 2-10μg/m L（r=0.999 7），and the average recovery of D-ribose is 99.99%（RSD 1.02%）.The methods reported in this paper are efficient，accurate and suitable for determination for polypeptide and ribose in transfer factor capsules.

transfer factor capsules；polypeptide；ribose；content determination

R927.2

A

1671-8798（2014）03-0172-05

10.3969/j.issn.1671-8798.2014.03.003

2014-03-05

浙江省農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目（浙科發(fā)農(nóng)[2013]171號-19）

周天瓊（1981― ），女，四川省成都人，工程師，主要從事生物醫(yī)藥原料藥、中間體和藥物制劑的研究和開發(fā)。

毛建衛(wèi)，教授，主要從事食品、生物活性物、醫(yī)藥合成等的生物化工研究和開發(fā)。