響應(yīng)面分析法優(yōu)化山楂葉中黃酮的提取工藝

施紅林，黃 琦，褚沈佳，庫(kù)娜娜，俞小燕，王媛媛

山楂葉為薔薇科植物山里紅或山楂的干燥葉，在中國(guó)具有悠久的保健與藥用歷史。山楂葉中含有大量的黃酮、17種氨基酸（包括8種人體必需的氨基酸），和一定量的微量元素和豐富的VC、VB1、VB2，以及綠原酸、山楂酸、膽堿、揮發(fā)油等。山楂葉中所含黃酮類成分對(duì)心血管系統(tǒng)疾病有明顯的藥理作用［1－2］，2005年版《中國(guó)藥典》正式收載山楂葉［3］。

本研究采用響應(yīng)面分析法對(duì)山楂葉中黃酮類化合物的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，采用乙醇回流法，先用單因素試驗(yàn)分析提取溫度、液固比、乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間4個(gè)主要因素對(duì)山楂葉中黃酮粗提取率的影響，再通過響應(yīng)面分析得出其最佳的提取條件，以期為山楂葉的深入開發(fā)與應(yīng)用提供重要的試驗(yàn)和理論依據(jù)。

1 儀器與試劑

DFY－500搖擺式高速中藥粉碎機(jī)（溫嶺市大德中藥器械有限公司），752紫外可見分光光度計(jì)（上海菁華科技儀器有限公司），BS224S電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），DKS－24型電熱恒溫水浴鍋（杭州藍(lán)天化驗(yàn)儀器廠），SHZ－D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（河南鞏義市英峪予華儀器廠）。

山楂葉烘干、研磨，過20目篩，置陰涼干燥處備用。亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。試驗(yàn)用水為蒸餾水。

2 試驗(yàn)方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用60%乙醇溶解后，移至100 mL容量瓶中，用60%乙醇溶液定容，即得0.10 mg／mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

精確量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50 mL，置于10 mL容量瓶中，分別加入5%的Na NO2溶液0.3 mL，搖勻放置6 min，再分別加入10%的Al（NO3）3溶液0.3 mL，搖勻放置6 min，最后分別加入4%的Na OH溶液4.0 mL，用60%乙醇溶液定容至10 mL，搖勻放置10 min。采用空白樣品作參比，在510 n m波長(zhǎng)測(cè)定其吸光度［4］。以吸光度A為縱坐標(biāo)，蘆丁的質(zhì)量濃度c（mg／mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2 山楂葉黃酮提取工藝及粗提取率計(jì)算

山楂葉黃酮提取工藝過程：山楂葉（干燥葉）→粉碎→過20目篩→乙醇熱回流提取→抽濾→定容→待測(cè)液。準(zhǔn)確移取待測(cè)液稀釋50倍，同2.1項(xiàng)下顯色、測(cè)定吸光度，計(jì)算測(cè)定提取液中黃酮的質(zhì)量濃度。總黃酮粗提取率公式為：

式中，c—提取液中黃酮的質(zhì)量濃度，mg／mL；W—稱取的山楂葉粉的質(zhì)量，g。

2.3 單因素試驗(yàn)

在山楂葉粉末目數(shù)一定的條件下，考察提取溫度、液固比、乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間對(duì)粗提取率的影響。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化分析山楂葉黃酮提取工藝

采用Dsign－Expert軟件處理數(shù)據(jù)，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取液固比（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、提取溫度（C）和提取時(shí)間（D）為試驗(yàn)因素，以黃酮粗提取率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)試驗(yàn)。響應(yīng)面因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平Table 1 Experi mental factors and levels in response surface design

2.5 山楂葉黃酮的鑒定

采用以下3種方法進(jìn)行山楂葉中黃酮類物質(zhì)的定性鑒定［5］。

2.5.1 鋁鹽顯色反應(yīng)

取山楂葉乙醇提取液，加入Al（NO3）3溶液搖勻，觀察溶液顏色，溶液顯亮黃色，說明為黃酮類化合物。

2.5.2 濃硫酸顯色反應(yīng)

取山楂葉乙醇提取液，加入幾滴濃硫酸，搖勻后觀察顏色變化，溶液由黃色變?yōu)槌壬?，說明為黃酮類化合物。

2.5.3 鹽酸－鎂粉顯色反應(yīng)

取山楂葉乙醇提取液，加入少量鎂粉振搖，再滴加濃鹽酸3～4滴，觀察顏色變化，溶液顏色由黃色變?yōu)榧t色，說明為黃酮類化合物。

3 結(jié)果與討論

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按2.1方法得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為：A＝26.162c＋0.002 7，相關(guān)系數(shù)r＝0.999 2，在試驗(yàn)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 提取溫度對(duì)粗提取率的影響

分別準(zhǔn)確稱取3 g山楂葉粉末5份置于5個(gè)圓底燒瓶中，各加入60%乙醇60 mL，分別在30、40、50、60、70℃水浴中提取30 min，測(cè)定吸光度，計(jì)算黃酮粗提取率，結(jié)果見圖1。

從圖1可知，提取溫度對(duì)山楂葉中黃酮的粗提取率有較大影響，粗提取率隨溫度的上升而增大，60℃時(shí)有最大粗提取率，60℃后粗提取率趨于平穩(wěn)。山楂葉組織隨溫度升高而逐漸軟化，細(xì)胞膨脹，同時(shí)，溫度升高降低了浸出液的黏度，增加了溶出成分的溶解度和擴(kuò)散速度，有利于有效成分浸出。

3.2.2 液固比對(duì)粗提取率的影響

分別準(zhǔn)確稱取3 g山楂葉粉末5份置于5個(gè)圓底燒瓶中，分別按液固比5、10、20、30、40 mL／g，用60%乙醇在60℃水浴中提取30 min，測(cè)定吸光度，計(jì)算黃酮粗提取率，結(jié)果見圖2。

從圖2可知，液固比對(duì)山楂葉中黃酮的粗提取率有較大影響，粗提取率隨液固比增大而增大，其中20 mL／g之后的增長(zhǎng)率較之前的增長(zhǎng)率緩慢。液固比反映了質(zhì)量濃度差，質(zhì)量濃度差所產(chǎn)生的滲透壓力是植物細(xì)胞組織與提取溶劑之間相平衡過程的主要推動(dòng)力。質(zhì)量濃度差越大，擴(kuò)散推動(dòng)力越大，越有利于提高浸取效率。但是液固比過高，提取效果的提高不會(huì)很明顯，而且會(huì)消耗大量的溶劑。

3.2.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)粗提取率的影響

分別準(zhǔn)確稱取3 g山楂葉粉末5份置于5個(gè)圓底燒瓶中，分別加入60 mL體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇，在60℃水浴中提取30 min，測(cè)定吸光度，計(jì)算黃酮粗提取率，結(jié)果見圖3。

從圖3可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)山楂葉黃酮粗提取率有較大影響，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%時(shí)，黃酮粗提取率最高，隨后略有下降趨勢(shì)。根據(jù)相似相溶原理，可能是山楂葉黃酮極性與70%的乙醇溶液的極性大致一致。另外，乙醇體積分?jǐn)?shù)過高，脂溶性物質(zhì)溶出也增加，干擾因素也隨之增大。因此，乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)定為70%左右為宜。

圖1 提取溫度對(duì)粗提取率的影響Fig.1 Effects of extraction temperature on extraction yield of flavonoids

圖2 液固比對(duì)粗提取率的影響Fig.2 Effects of liquid－solid ratio on extraction yield of flavonoids

3.2.4 提取時(shí)間對(duì)粗提取率的影響

分別準(zhǔn)確稱取3 g山楂葉粉末5份置于5個(gè)圓底燒瓶中，分別加入60%乙醇60 mL，于60℃水浴中分別提取10、15、20、30、40 min，測(cè)定吸光度，計(jì)算出黃酮的粗提取率，結(jié)果見圖4。

從圖4可知，提取時(shí)間對(duì)粗提取率的影響呈先上升后下降的趨勢(shì)，30 min時(shí)有最大粗提取率。提取時(shí)間太短，山楂葉中的黃酮類物質(zhì)浸出太少；提取時(shí)間過長(zhǎng)，可能是提取出的部分黃酮不穩(wěn)定而被破壞分解，使得粗提取率略有下降趨勢(shì)。因此，提取時(shí)間定為30 min左右為宜。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)粗提取率的影響Fig.3 Effects of ethanol concentration on extraction yield of flavonoids

圖4 提取時(shí)間對(duì)粗提取率的影響Fig.4 Effects of extraction ti me on extraction yield of flavonoids

3.3 山楂葉黃酮提取的響應(yīng)面優(yōu)化分析

根據(jù)Box－Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以黃酮的粗提取率為目標(biāo)函數(shù)，選取液固比（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、提取時(shí)間（C）和提取溫度（D）為自變量，設(shè)計(jì)4因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。設(shè)計(jì)方案與結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Arrangement and experimental results of response surface design

采用Design－Expert統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析，回歸二次方程的方差顯著性檢驗(yàn)分析結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面分析法對(duì)黃酮粗提取率的方差分析Table 3 Analysis of variance of the constructed regression model

采用響應(yīng)面分析法分析試驗(yàn)結(jié)果，建立二次響應(yīng)面回歸模型，以山楂葉黃酮的粗提取率為響應(yīng)值的回歸方程為：

粗提取率＝2.82＋0.32A＋26B＋0.092C＋0.056D＋0.082AB－0.010AC＋0.023AD＋0.020BC＋0.010BD－0.015CD－0.20A2－0.21B2－0.11C2－0.11D2

P值的大小表明模型及各考察因素的顯著水平。由表3可知，以山楂葉中黃酮的粗提取率為響應(yīng)值時(shí)，回歸方程顯著性檢驗(yàn)P＜0.000 1，表明該二次方程模型極顯著；同時(shí)，失擬項(xiàng)P＝0.193 5＞0.100 0，不顯著，表明試驗(yàn)結(jié)果和數(shù)學(xué)模型擬合良好，即可用該數(shù)學(xué)模型推測(cè)試驗(yàn)結(jié)果［6］。模型的調(diào)整確定系數(shù)R2Adj＝0.980 3，說明模型擬合度好，響應(yīng)值的98.03%是由于所選變量引起，表明實(shí)際值與預(yù)測(cè)值具有較好的擬合相關(guān)性，可以用該回歸方程確定最佳提取工藝［7］。

通過模型的回歸方差分析（表3）可以看出，液固比A（P＜0.000 1）、乙醇體積分?jǐn)?shù)B（P＜0.000 1）對(duì)粗提取率的影響是極顯著的，提取溫度C（P＝0.010 7）、交互相AB（P＝0.048 5）對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響顯著，而提取時(shí)間D（P＝0.094 7）對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響不顯著。4個(gè)因素之間的交互作用見圖5～圖10。

從等高線圖可直觀反映出2個(gè)變量間交互作用的顯著程度，等高線圖的圓心越接近橢圓，表示交互作用越強(qiáng)，等高線的稀疏表示響應(yīng)面圖形的平陡［8］。由圖5可見，液固比（A）和乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）交互作用顯著，黃酮粗提取率隨液固比和乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而增加且有增速趨緩的走勢(shì)。由圖6可見，黃酮的粗提取率隨提取溫度（C）和液固比（A）的升高而增加，但提取溫度升高到一定程度以后，不再上升，這是因?yàn)檫^高的溫度使得所提取出的一部分對(duì)熱不穩(wěn)定的黃酮成分被破壞，從而影響了粗提取率。由圖7可見，隨著液固比（A）和提取時(shí)間（D）的增加，黃酮的粗提取率隨之增加，根據(jù)提取動(dòng)力學(xué)理論，提取時(shí)間的延長(zhǎng)有助于黃酮的充分?jǐn)U散析出，但過長(zhǎng)的提取時(shí)間會(huì)加劇黃酮在較高溫度環(huán)境中的破壞，從而影響黃酮的粗提取率。由圖8和圖9可見，黃酮的粗提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）的升高而增加，根據(jù)相似相溶的原理，最佳的乙醇體積分?jǐn)?shù)是由山楂葉黃酮的極性決定的。圖10中等高線圖形趨于圓形，表明提取溫度（C）與提取時(shí)間（D）的相互作用不顯著。

圖5 液固比和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮粗提取率影響的響應(yīng)面和等高線Fig.5 Response surface and contour line of liquid－solid ratio and ethanol concentration

圖6 液固比和提取溫度對(duì)黃酮粗提取率影響的響應(yīng)面和等高線Fig.6 Response surface and contour line of liquid－solid ratio and extraction temperature

圖7 液固比和提取時(shí)間對(duì)黃酮粗提取率影響的響應(yīng)面和等高線Fig.7 Response surface and contour line of liquid－solid ratio and extraction ti me

圖8 乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度對(duì)黃酮粗提取率影響的響應(yīng)面和等高線Fig.8 Response surface and contour line of ethanol concentration and extraction temperature

圖9 乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間對(duì)黃酮粗提取率影響的響應(yīng)面和等高線Fig.9 Response surface and contour line of ethanol concentration and extraction time

圖10 提取溫度和提取時(shí)間對(duì)黃酮粗提取率影響的響應(yīng)面和等高線Fig.10 Response surface and contour line of extraction temperature and extraction ti me

通過Design－Expert軟件分析，在各因素試驗(yàn)水平范圍內(nèi)，得出山楂葉黃酮的醇提理論最佳工藝條件為：液固比29 mL／g、乙醇體積分?jǐn)?shù)68%、提取溫度64℃，提取時(shí)間34 min。在所得的最佳提取工藝條件下連續(xù)進(jìn)行3次山楂葉黃酮的提取試驗(yàn)，測(cè)得平均粗提取率為3.07%，RSD為1.512%，與預(yù)測(cè)粗提取率3.11%接近，說明該方程與實(shí)際情況擬合性良好。

3.4 山楂葉黃酮定性鑒定結(jié)果

山楂葉黃酮定性鑒定結(jié)果如表4所示，結(jié)果表明，山楂葉乙醇提取物是黃酮類化合物。

表4 山楂葉黃酮定性鑒定結(jié)果Table 4 Qualitative analysis of flavonoids fr om howt hor n leaves

4 結(jié) 語(yǔ)

綜合單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，得出了試驗(yàn)條件下山楂葉黃酮最佳提取工藝：以山楂葉粉末為原料，液固比29 mL／g，乙醇體積分?jǐn)?shù)68%，水浴溫度64℃，提取時(shí)間34 min，在此條件下的平均粗提取率達(dá)3.07%，與預(yù)測(cè)值基本相符，說明響應(yīng)面優(yōu)化得到的提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確、可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

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