柴黃片血清藥物化學(xué)的初步研究

張美玲趙 萃梁現(xiàn)蕊蔡鐘欽

1浙江省立同德醫(yī)院藥學(xué)部 杭州 310012 2浙江省中醫(yī)藥研究院3浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院 綠色制藥技術(shù)與裝備教育部重點實驗室

柴黃片血清藥物化學(xué)的初步研究

張美玲1，2趙 萃3梁現(xiàn)蕊3蔡鐘欽1，2

1浙江省立同德醫(yī)院藥學(xué)部 杭州 310012 2浙江省中醫(yī)藥研究院3浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院 綠色制藥技術(shù)與裝備教育部重點實驗室

目的 通過對柴黃片血清藥物化學(xué)研究方法的建立，探討柴黃片口服吸收后的入血成分。方法 采用血清藥物化學(xué)研究方法，在建立柴黃片超高效液相色譜（UPLC）特征圖譜的基礎(chǔ)上，通過比較柴黃片原藥、柴胡給藥后含藥血清、黃芩給藥后含藥血清、柴黃片給藥后含藥血清、空白血清UPLC特征圖譜，鑒定柴黃片口服給藥后的血中移行成分。結(jié)果 口服柴黃片后，從血清中發(fā)現(xiàn)20個入血成分，其中6個為柴黃片中原型吸收入血的成分，其余入血成分可能為原型成分的代謝產(chǎn)物。結(jié)論 20個入血成分可能是柴黃片的體內(nèi)直接作用物質(zhì)，對其進(jìn)行深入研究將有助于為柴黃片的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及藥效機制奠定基礎(chǔ)。

柴黃片；超高效液相；入血成分；特征圖譜

中藥血清藥物化學(xué)是基于中藥體內(nèi)直接作用物質(zhì)的形成過程及中藥有效成分體內(nèi)過程的研究提出發(fā)展起來的。中藥血清藥物化學(xué)在全面分析方劑中血中移行成分、確定方劑藥效物質(zhì)基礎(chǔ)上，通過主要藥效成分的體內(nèi)動態(tài)、成分間相互作用及消長規(guī)律的研究，在一定程度上解決中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制問題，科學(xué)地詮釋方劑的配伍規(guī)律，能使中醫(yī)藥的理論及實踐實現(xiàn)實質(zhì)性的進(jìn)步和發(fā)展[1]。柴黃片收載于2010年版《中國藥典》第一部，由柴胡、黃芩兩味中藥按1：1配比經(jīng)現(xiàn)代工藝加工制備而成，具有清熱解表的功效；本研究首次采用血清藥物化學(xué)方法研究柴黃片進(jìn)入血液后的原形藥物及其代謝產(chǎn)物的存在狀況及譜效關(guān)系，逆向追溯柴黃片有效活性物質(zhì)，以詮釋柴胡、黃芩藥對配伍應(yīng)用的原理與規(guī)律。

1 實驗材料

1.1 動 物 健康成年SD大鼠20只，雌雄各半，平均體質(zhì)量（220±20）g，均為清潔級動物，檢疫合格。購自浙江大學(xué)動物實驗中心，許可證號：SYXK（浙）2012-0178。

1.2 儀 器 超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）是由 Waters Acquity系統(tǒng)，二元溶液輸送泵，自動取樣器，二極管陣列檢測器組成，并與Waters Empower軟件相連；低溫冷凍高速離心機（eppendorf centrifuge 5810R）。

1.3 藥品與試劑 柴胡、黃芩（杭州華東中藥飲片有限公司）；柴黃片（四川百利藥業(yè)有限責(zé)任公司,每片含生藥量2g，批號120801）；黃芩素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98.5%，批號111595～200905）、漢黃芩素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%，批號111514～200403）和黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥91.7%，批號110715～201117）、柴胡皂苷a（純度≥90.5%，批號110777-201108）、柴胡皂苷d（純度≥94.6%，批號110778-201208）（中國食品藥品檢定研究所）；漢黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%，批號130225）（上海友思生物技術(shù)有限公司）；HPLC級的乙腈和甲醇（默克公司）；其他所有分析級的化學(xué)品（天津永大化學(xué)試劑有限公司）；超純水由Barnstead TII超級純水系統(tǒng)制備。

2 實驗方法

2.1 對照品溶液制備 精密稱取黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素對照品適量置深色容量瓶中，加適量甲醇溶解并稀釋，制成濃度為0.5mg/mL的儲備液，備用。

2.2 柴黃片供試品溶液制備 取柴黃片10片，糖衣片去除糖衣，研細(xì)，取約0.5g（相當(dāng)于生藥2g），精密稱定，置100mL量瓶中，加70%乙醇80mL，超聲處理45min，放冷，加70%乙醇至刻度，搖勻，濾過。精密量取濾液5mL置20mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即為供試品溶液。

2.3 柴胡、黃芩、柴黃片灌胃液制備 取柴胡、黃芩各200g，分別加適量水煎煮2次，第一次2h，第二次1h，合并煎煮液；煎煮液分別濃縮，制成濃度為2.85g/ mL的柴胡灌胃液（總量70mL），濃度為1.66g/mL的黃芩灌胃液（總量120mL）。取柴黃片25片（每片含生藥量2g），除糖衣，碾碎用適量蒸餾水混合，制成濃度為1.67g/mL的灌胃液（總量30mL）。

2.4 含藥血清、空白血清的制備 取Wistar大鼠20只隨機進(jìn)行編號并分為空白組、柴胡組、黃芩組、柴黃片組，各5只。分籠飼養(yǎng)，禁食12h（自由飲水），按照大鼠體質(zhì)量（25g生藥量/kg）給藥[2]，于每天早上8點、晚上8點分別灌胃（空白組給予蒸餾水3mL/ 200g、柴黃片組給予柴黃片灌胃液3mL/200g、柴胡組給予柴胡提取液1.8mL/200g、黃芩組給予黃芩提取液3mL/200g），給藥3天后，分別于末次給藥30min、1h、2h后以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，無菌下腹主動脈取血5mL，置無菌試管中，3000r/min條件下離心10min，取上清液加入0.2mL 70%高氯酸，渦旋振蕩15s后以10 000r/min轉(zhuǎn)速離心10min，上層清液經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，即得[3]。

2.5 UPLC分析

2.5.1 色譜條件 色譜分離方法：使用Waters Acquity BEH C18柱，50×2.1mm，1.7μm。流動相由A（0.1%磷酸，pH2.2）and B（乙腈）組成，其梯度洗脫的程序如下：0～11min，15%～45%B；11～12min，45%B，流速為0.2mL/min，柱溫30℃，檢測波長設(shè)為276nm。

2.5.2 穩(wěn)定性檢測 按照“2.2”提取并制備柴黃片樣品溶液，采用“2.5”UPLC條件分別在0、2、4、6、8、10h進(jìn)樣（分別標(biāo)記為1號、2號、3號、4號、5號 、6號），計算黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素在276nm和 203nm波長下的保留時間 RSD均＜0.281%，說明樣品溶液日內(nèi)基本穩(wěn)定。見表1、2。

表1 穩(wěn)定性試驗結(jié)果（203nm）

表2 穩(wěn)定性試驗結(jié)果（276nm）

2.5.3 重復(fù)性檢測 按照“2.2”提取并制備柴黃片樣品溶液6份（分別標(biāo)記為1號、2號、3號、4號、5號、6號），采用“3.1”UPLC條件測定，計算黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素在276nm和203nm波長下的保留時間RSD均＜0.197%，說明制備樣品溶液的重現(xiàn)性較好。見表3、4。

表3 重復(fù)性試驗結(jié)果（203nm）

表4 重復(fù)性試驗結(jié)果（276nm）

2.6 分析方法 分別取各對照品溶液、柴黃片提取物、柴胡給藥后血清、黃芩給藥后血清、柴黃片給藥后血清、空白血清等樣品，在相同的UPLC色譜條件下進(jìn)行分析，建立UPLC圖，根據(jù)色譜峰保留時間、紫外特征光譜和對照品信息，比較確定柴黃片血中移行成分。

3 實驗結(jié)果

3.1 柴黃片化學(xué)成分分析 柴黃片和柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素各標(biāo)準(zhǔn)品的UPLC圖,見圖1～2，通過對比保留時間及各峰的紫外吸收，明確柴黃片中11號峰為黃芩中的黃芩苷，18號峰為黃芩中的漢黃芩苷，19號峰為黃芩中的黃芩素，20號峰為為黃芩中的漢黃芩素；柴胡皂苷a和柴胡皂苷d未在柴黃片中檢測出；其余12、13、14、15、21號峰為黃芩或柴胡的其他成分。

3.2 柴黃片血中移行成分分析 柴黃片含藥血清中共檢測到20個血中移行成分，其中11、13、15、18、19、20為柴黃片中原型成分移行入血；1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、17號峰是體內(nèi)代謝成分。通過比對柴胡給藥后血清、黃芩給藥后血清保留時間及各峰的紫外吸收，推測1、7、8、9、10、16、17號峰為黃芩體內(nèi)代謝成分，而2、3、4、5、6、12、14號峰是柴胡與黃芩在體內(nèi)相互作用后的產(chǎn)物。柴胡、黃芩及柴黃片的含藥血清UPLC見圖3～5。

圖1 柴胡皂苷標(biāo)準(zhǔn)品和柴黃片UPLC圖（203nm）；a柴胡皂苷a標(biāo)準(zhǔn)品；b柴胡皂苷d標(biāo)準(zhǔn)品；c柴黃片

圖2 黃芩標(biāo)準(zhǔn)品和柴黃片UPLC圖（276nm）；a黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品；b漢黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品；c黃芩素標(biāo)準(zhǔn)品；d漢黃芩素標(biāo)準(zhǔn)品；e柴黃片

4 討論

柴黃片收載于2010年版《中國藥典》，具有清熱解表的功效，用于風(fēng)熱感冒引起的發(fā)熱、周身不適、頭痛目眩、咽喉腫痛等癥，藥理研究表明其具有解熱、抗菌、抗過敏、保肝利膽等作用。柴胡、黃芩均始載于東漢《神農(nóng)本草經(jīng)》，柴胡具有解表退熱、疏肝解郁、升舉陽氣之功，其主要有效成分為柴胡皂苷、植物甾醇、側(cè)金盞花醇等；近十年來分離鑒定的皂苷有四十余種，其中報道最多的是柴胡皂苷a、柴胡皂苷b和柴胡皂苷d。黃芩有清熱燥濕、瀉火解毒、涼血止血、除熱安胎的功能，含有多種黃酮類化合物其中黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素等為黃芩的特征化學(xué)成分。柴胡、黃芩中含有的主要成分黃酮類最大吸收波長在276nm左右[4]，皂苷類最大吸收波長在203nm[5]。為了獲得最佳的檢測波長，實驗中用檢測器對200～700nm波長范圍進(jìn)行了掃描，重點考察203nm、276nm和330nm這三個波長。

圖3 柴黃片大鼠給藥前后UPLC圖（276nm）；a空白血清；b柴黃片；c柴黃片給藥后血清

圖4 柴胡、黃芩、柴黃片大鼠給藥后UPLC圖（203nm）；a空白血清；b柴胡給藥后血清；c黃芩給藥后血清；d柴黃片給藥后血清

圖5 柴胡、黃芩、柴黃片大鼠給藥后UPLC圖（276nm）；a空白血清；b柴胡給藥后血清；c黃芩給藥后血清；d柴黃片給藥后血清

柴胡中柴胡皂苷a、d在提取過程中易受酚類或酸類成分影響轉(zhuǎn)化為皂苷b1、b2，故需采用弱堿性溶劑提取，根據(jù)文獻(xiàn)報道用5%氨水-甲醇進(jìn)行超聲提取或閃式提取效率高、易于檢測到相應(yīng)成分[6]，本實驗中采用5%氨水-甲醇對柴胡生藥進(jìn)行提取后成功檢測到柴胡皂苷a、d成分，但柴胡提取液和柴黃片的檢測中沒有出現(xiàn)柴胡皂苷a、d的峰值，提示單純的煎煮法及片劑的生產(chǎn)工藝中柴胡皂苷a、d已受影響。

中藥復(fù)方成分復(fù)雜，其進(jìn)入體內(nèi)后又經(jīng)歷一系列的生物轉(zhuǎn)化過程，有些成分以原形入血，有些成分轉(zhuǎn)化為其代謝產(chǎn)物，有些成分則直接作用于體內(nèi)靶點，使其分泌生理活性物質(zhì)，致使進(jìn)入血中的成分與體外相比會發(fā)生很大變化。本研究發(fā)現(xiàn)，柴黃片含藥血清與體外圖譜相比，含藥血清中共有14個新增色譜峰；14個色譜峰中，有7個峰的保留位置與黃芩含藥血清色譜峰相一致，基本可認(rèn)定為黃芩體內(nèi)代謝成分，而另7個既非正常大鼠血清中生理活性成分，也不是柴胡體內(nèi)代謝成分，推測為黃芩與柴胡相互作用后進(jìn)入血中的產(chǎn)物，或是藥物作用大鼠而產(chǎn)生的內(nèi)源性活性物質(zhì)，有待于進(jìn)一步的研究。

本實驗首次采用超高效液相色譜法對柴黃片血中移行成分進(jìn)行分析，建立的方法顯示了良好的靈敏度、準(zhǔn)確度、精確度、線性、穩(wěn)定性和回收率，能夠全面反映柴黃片口服后吸收入血的藥物成分，為確定柴黃片藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及代謝研究奠定基礎(chǔ)。

［1］柯瑋，朱建華.中藥血清藥理方法學(xué)的研究概況［J］.中國中醫(yī)藥指南，2011，9（6）：24-25.

［2］王喜軍，張寧，曹洪欣，等.復(fù)方安替威膠囊大鼠血清藥物化學(xué)的初步研究［J］.中國中藥雜志，2006，31（18）：1538-1540.

［3］鄭林，陳慧，王愛民，等.超高效液相色譜測定大鼠口服葒草花后入血成分［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2012，32（2）：91-93.

［4］陳平平，董婉茹，曹敏，等.黃芩血清藥物化學(xué)的初步研究［J］.中醫(yī)藥信息，2010，27（5）：32-34.

［5］劉金欣，孟繁蘊，魏英勤，等.UPLC-ELSD同時測定北柴胡中柴胡皂苷a、c、d的含量［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，19（5）：83-86.

［6］湯芳玲，付珣，朱珍真，等.UPLC法測定小葉黑柴胡的根中柴胡皂苷a、d含量［J］.藥物分析雜志，2011，31（9）：1654-1657.

Preliminary Study on Serum Pharmacochemistry of Chaihuang Tablets

ZHANG Meiling1，2,ZHAO Cui3,LIANG Xianrui3,CAI zhongqin1，2. 1.Department of Pharmacy,Zhejiang Provincial TongdeHospital,Hangzhou（310012）,China;2.Traditional Chinese Medicine Academy of Zhejiang;3.Ministry of Education Key Laboratory of Green Pharmaceutical Technology and Equipment,College of Pharmaceutical Sciences,Zhejiang University of Technology.

Objective To explore the bioactive constituents of Chaihuang tablets by serum pharmacochemistry method.Methods Ultra performance liquid chromatography fingerprints of Chaihuang tablets were established.The blood migrating constituents of Chaihuang tablets were determined by comparing the UPLC fingerprints of Chaihuang tablets,Chaihuang-contained serum samples,Chaihu-contained serum samples,Huangqin-contained serum samples,and blank serum samples.Results Twenty compounds absorbed into the blood were detected,of which 6 were original constituents of Chaihuang tablets and the rest might be metabolites of the original ones.Conclusion The 20 constituents absorbed in the blood might be the bioactive components of Chaihuang tablets.Further studies on them would be useful to clarify the bioactive constituents and mechanism of action of Chaihuang tablets.

Chaihuang tablets；ultra performance liquid chromatography；absorbed constituents in the blood；fingerprints

2014-06-24

修回日期：2014-07-29

浙江省公益性技術(shù)應(yīng)用研究（分析測試）計劃項目（No.2012C37043）

張美玲，Tel：（0571）89972240；E-mail：zml9998@sina.com