富含脯氨酸的酪氨酸激酶2生物功能及藥物研究進展

張 釗，楚世峰，陳乃宏

（天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點實驗室，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，北京 100050）

富含脯氨酸的酪氨酸激酶2（proline-rich tyrosine kinase 2，Pyk2）又稱 CAKβ（cell adhesion kinase beta）、RAFTK（related adhesion focal tyrosine kinase）、FAK2（focal adhesion kinase 2），是粘著斑激酶FAK家族重要成員之一。已有研究表明Pyk2在腫瘤遷移、免疫系統(tǒng)疾病及骨代謝等方面都有重要作用，了解其分布、結(jié)構(gòu)及調(diào)控機制將為我們更好地進行藥物設(shè)計及疾病治療提供理論依據(jù)。

1 Pyk2的分布

人Pyk2基因定位于8號染色體上（8p21.1），與FAK含有相似的結(jié)構(gòu)域，其分子序列上的同源率約為45%，而中心激酶區(qū)結(jié)構(gòu)域同源率高達60%。Pyk2主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)及造血系統(tǒng)，在小腸、腎、脾及睪丸中也有表達。大鼠腦組織中Pyk2在海馬、大腦皮層及嗅球中選擇性高表達；腎臟中Pyk2蛋白主要位于近端小管細胞。除Pyk2全長外，Pyk2還存在兩種剪切異構(gòu)體。相比全長，一個在C末端的兩個富含脯氨酸的序列中缺失了一段表達42個氨基酸的外顯子，稱為Pyk2s（Pyk2 splice form）；另一個僅編碼Pyk2 C末端結(jié)構(gòu)域的一部分，被命名為PRNK（Pyk2-related non-kinase）。Pyk2全長主要位于腦中，而剪切體Pyk2s及PRNK主要在脾中表達，腦組織表達較低。研究表明Pyk2的功能多樣性可能與其剪切異構(gòu)體相關(guān)。

2 Pyk2的結(jié)構(gòu)域

Pyk2的功能性結(jié)構(gòu)域包括N-端FERM結(jié)構(gòu)域、中心激酶結(jié)構(gòu)域、富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域、C-端FAT結(jié)構(gòu)域。具體結(jié)構(gòu)及功能如下：

2.1 FERM結(jié)構(gòu)域 Pyk2的 N-端為 FERM（protein4.1-ezrin-radixin-moesin）結(jié)構(gòu)域，編碼330個氨基酸。FERM結(jié)構(gòu)域形似壓縮的三葉草，含有3個模體（分別命名為F1，F(xiàn)2和F3），能夠介導(dǎo)蛋白與蛋白以及蛋白與膜之間的相互作用。磷脂酰肌醇二磷酸（PIP2）結(jié)合在F1和F3之間的縫隙中，誘導(dǎo)Pyk2構(gòu)象改變，暴露出FERM蛋白序列，導(dǎo)致其與跨膜蛋白胞內(nèi)尾段結(jié)合［1］。FERM結(jié)構(gòu)域突變抑制Pyk2的磷酸化，可能與FERM介導(dǎo)的蛋白相互作用或Pyk2胞內(nèi)分布的改變有關(guān)。最近研究發(fā)現(xiàn)哺乳動物Ste20同源物MAP4K4與Pyk2 FERM結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合，促進膠質(zhì)瘤細胞遷移。提示抑制MAP4K4與Pyk2 FERM結(jié)構(gòu)域的結(jié)合可能為控制膠質(zhì)母細胞瘤擴散提供新的治療策略［2］。

2.2 中心激酶結(jié)構(gòu)域 FERM結(jié)構(gòu)域通過一段約40個氨基酸的短肽與Pyk2中心激酶結(jié)構(gòu)域相連，此連接短肽的377-380位殘基為一個Pro-X-X-Pro模體，402位為酪氨酸自磷酸化位點（Tyr402）。激酶結(jié)構(gòu)域為雙葉型結(jié)構(gòu)，其Tyr402磷酸化可為含SH2結(jié)構(gòu)的蛋白（如Src和p85）提供結(jié)合位點，Src的結(jié)合導(dǎo)致Pyk2的Tyr579及Tyr580位點磷酸化，從而激發(fā)Pyk2最大的激酶活性。Pyk2激酶結(jié)構(gòu)域與FAK催化結(jié)構(gòu)域的同源率為60%，且與其他蛋白酪氨酸激酶也表現(xiàn)出高同源性。而Pyk2特有的Asp-Phe-Gly（DFG）模體可激活回路，其構(gòu)型上的特異性使其成為選擇性激酶抑制劑的靶點［3］。

2.3 富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域 Pyk2兩個富含脯氨酸的序列（713Pro-Pro-Pro-Lys-Pro-Ser-Arg-Pro720和855Pro-Pro-Gln-Lys-Pro-Pro-Arg-Leu862）位于激酶結(jié)構(gòu)域之后，能介導(dǎo)Pyk2和一些含有SH3結(jié)構(gòu)的蛋白（包括p130Cas、ASAP1、PSGAP、Graf等）相互作用。Aoto等［4］研究發(fā)現(xiàn)Pyk2第2個富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域突變可引起其核定位的增多，繼而引發(fā)Hic-5聚集，提示Pyk2可能在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中也發(fā)揮重要作用。

2.4 FAT結(jié)構(gòu)域 Pyk2 C-端的黏附結(jié)構(gòu)域（FAT）可使Pyk2定位于局部黏附部位。Pyk2的FAT結(jié)構(gòu)域為反向平行的四螺旋體結(jié)構(gòu)［5］，可以介導(dǎo)Pyk2與paxillin以及凝膠溶素C-端的LD模體相互作用，進而影響Pyk2對肌動蛋白骨架重組的調(diào)控［6］。FAT結(jié)構(gòu)域內(nèi)含有Tyr881位點，其被Src磷酸化后可成為Grb2銜接子結(jié)合位點，進而調(diào)控MAPK信號通路［7］。

3 Pyk2的主要功能

3.1 Pyk2對免疫系統(tǒng)的影響 Pyk2在免疫細胞尤其是巨噬細胞及B細胞的生物學(xué)功能方面起重要作用。Okigaki等［8］發(fā)現(xiàn)同源重組敲除Pyk2后產(chǎn)生的小鼠不僅能夠存活，而且可生育且無表型異常。而Pyk2-／-小鼠T細胞、B細胞、NK細胞、巨噬細胞等的分布卻發(fā)生了明顯的變化，表現(xiàn)為Pyk2-／-小鼠來源的B細胞運動活性及對細胞因子的反應(yīng)性明顯降低［9］。在細胞因子的刺激下，Pyk2-／-小鼠的巨噬細胞前端板狀偽足的形成明顯延遲，并且尾端不能從基質(zhì)黏附中撤離，從而導(dǎo)致其遷移能力的急劇下降。進一步研究發(fā)現(xiàn)無論有無細胞因子存在，與野生型巨噬細胞相比，這些巨噬細胞伸展能力都明顯增加，形成更大的無方向性的板狀偽足。Pyk2回復(fù)后遷移表型也得到了恢復(fù)，且在Pyk2-／-的巨噬細胞中未能檢測到FAK過表達。在細胞因子的刺激下，Pyk2-／-小鼠分離的巨噬細胞前端的板狀偽足中并未發(fā)現(xiàn)F-actin的富集，而是在膜上發(fā)現(xiàn)許多定位不同及方向不定的膜褶皺。以上研究表明趨化刺激下Pyk2在骨架成分重組及運動極性的形成中起了重要作用。

3.2 Pyk2在腫瘤中的作用 大量研究表明過表達Pyk2不僅能夠促進腫瘤細胞增殖，而且可促進腫瘤細胞的遷移。Lim等［10］研究發(fā)現(xiàn) Pyk2的 FERM結(jié)構(gòu)域能夠促進依賴Mdm2的p53泛素化降解，促進細胞以不依賴激酶的方式生長，而敲除Pyk2可增加p53水平，將細胞阻滯于G1期從而抑制細胞增殖。Pyk2在惡化的乳腺癌細胞中表達明顯增多，在早期導(dǎo)管原位癌（DCIS）及侵襲性乳腺癌中與ErbB-2共同高表達［11］。早期研究發(fā)現(xiàn)肝癌細胞中Pyk2的過表達與其轉(zhuǎn)移能力增強及存活率減少有關(guān)［12-13］。近期 Liu等［14］進一步研究發(fā)現(xiàn)肝癌發(fā)展中伴隨著miR-517a及 miR-517c的表達下調(diào)，Pyk2作為miR-517a及 miR-517c的靶蛋白可以解除其對G2／M轉(zhuǎn)化的抑制，進而促進肝癌的發(fā)生和發(fā)展。非小細胞肺癌中Pyk2的表達量也明顯升高，并與其遷移能力成正比［15-16］。此外，神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤中Pyk2的表達量也呈現(xiàn)明顯的升高［17］。Loftus等［18］研究發(fā)現(xiàn) Pyk2具有促進神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞遷移和侵襲的功能，并證明FERM結(jié)構(gòu)域在Pyk2促進神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞遷移中起重要作用，可作為抑制神經(jīng)膠質(zhì)細胞遷移的靶點。近期研究發(fā)現(xiàn)Pyk2表達上調(diào)能夠通過Wnt／β-Catenin途徑，使多發(fā)性骨髓瘤（MM）細胞穩(wěn)定黏附于骨髓源基質(zhì)細胞（BMSCs），導(dǎo)致多發(fā)性骨髓瘤細胞產(chǎn)生對硼替佐米（bortezomib）的耐藥性［19］。最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明伊馬替尼（imatinib）雖然是目前治療慢性粒細胞白血病（CML）的一線藥物，卻能大大增加CML病人的髓外復(fù)發(fā)（EMR）機率。Ovcharenko等［20］對其機制進行了研究，發(fā)現(xiàn)伊馬替尼作用于CML細胞系K562后，可使Pyk2 mRNA及蛋白表達水平出現(xiàn)明顯上調(diào)，從而增強K562黏附、遷移及侵襲能力；同樣的現(xiàn)象在全反式維甲酸處理的急性早幼粒細胞白血?。ˋPL）細胞系NB4中也可以觀察到，提示Pyk2靶向抑制可以有效降低CML及APL髓外復(fù)發(fā)機率。

3.3 Pyk2對骨代謝的影響 正常情況下，成骨細胞與破骨細胞處于平衡狀態(tài)。骨質(zhì)疏松患者體內(nèi)成骨細胞及破骨細胞的平衡被打破，破骨細胞過度活化，骨吸收增加。Buckbinder等［21］發(fā)現(xiàn)Pyk2為骨細胞分化抑制子，前成骨細胞在Pyk2敲除小鼠中的分化和活性增加，促使骨生成進而增加骨量。Pyk2在成骨細胞和破骨細胞中都有表達，成骨細胞中敲除Pyk2影響其分化、遷移及肌動蛋白的骨架重組，影響局部黏附的回復(fù)［21-22］。破骨細胞中，Pyk2定位于偽足小體周邊，敲除Pyk2結(jié)構(gòu)形成無序的偽足小體［23］，并導(dǎo)致破骨細胞骨重吸收能力的降低，進而導(dǎo)致骨硬化［21，23］。已有研究表明Pyk2參與αvβ3整合素介導(dǎo)的信號途徑，在調(diào)控破骨細胞功能中起重要作用，體內(nèi)體外實驗表明抑制αvβ3整合素可以抑制骨吸收［24］，推測針對Pyk2的調(diào)控可能對骨科疾病如骨質(zhì)疏松、牙周病等疾病的發(fā)展產(chǎn)生影響。近期研究發(fā)現(xiàn)Pyk2-／-小鼠補充少量雌二醇可明顯增加其骨容量，提示雌二醇聯(lián)合Pyk2靶向干預(yù)有望成為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的新療法。

Tab 1 Drug development targeting Pyk2

4 Pyk2與FAK同源性及功能差異

如前所述，Pyk2與FAK不僅具有高度序列同源性，還具有許多相似的生物學(xué)功能。Weis等［25］研究FAK在成年小鼠內(nèi)皮細胞血管生成中的作用時發(fā)現(xiàn)，敲除FAK會引起Pyk2表達量代償性的升高。在FAK缺失的情況下，Pyk2可代償性地激活整合素依賴的信號傳導(dǎo)通路。上述結(jié)果提示，在血管生成過程中，F(xiàn)AK與Pyk2兩者具有相互代償?shù)哪芰Α?/p>

雖然Pyk2與FAK具有高度的同源性，二者之間也存在著明顯的區(qū)別。相比Pyk2集中于中樞神經(jīng)系統(tǒng)及造血系統(tǒng)高表達，F(xiàn)AK在各組織均普遍存在；Pyk2的激活也與FAK有一定的區(qū)別，F(xiàn)AK主要被整合素介導(dǎo)的胞外基質(zhì)黏附所激活，而Pyk2雖然能被整合素介導(dǎo)的黏附激活，但其主要對能引起胞內(nèi)Ca2+升高的各種刺激起反應(yīng)［26］。此外，Lipinskin等［27］研究發(fā)現(xiàn)Pyk2及FAK在惡性膠質(zhì)瘤遷移及增殖中的作用不同，F(xiàn)AK過表達抑制細胞遷移，促進細胞增殖；與之相反的是Pyk2過表達促進細胞遷移，抑制細胞增殖，表明兩者在腫瘤增殖和遷移的發(fā)生發(fā)展過程中依賴于不同的調(diào)控機制。

5 以Pyk2為靶點的新藥研發(fā)進展

實驗表明，F(xiàn)ERM結(jié)構(gòu)域在調(diào)控Pyk2的活性中起重要作用。Pyk2 FERM結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體12A10能特異性識別并結(jié)合于FERM結(jié)構(gòu)域F3模體的β5C-α1C表面，覆蓋了在Pyk2活性中起重要作用的位點，從而抑制其活性。同時12A10也被證明具有Pyk2特異性，不能與FAK的FERM結(jié)構(gòu)域結(jié)合。生物學(xué)功能研究表明12A10可劑量依賴性的抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的遷移［18］。采用Pyk2 FERM結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)篩選其小分子抑制劑，篩選得到的化合物不僅能夠特異性結(jié)合Pyk2的FERM結(jié)構(gòu)域，而且可抑制FERM結(jié)構(gòu)域與12A10單克隆抗體的結(jié)合。生物學(xué)實驗表明它們也可以有效地抑制Pyk2介導(dǎo)的神經(jīng)膠質(zhì)細胞的遷移。此工作證明FERM結(jié)構(gòu)域可以作為抑制Pyk2活性的激酶區(qū)外新型靶位，有效的靶向蛋白-蛋白相互作用以調(diào)控Pyk2激酶活性進而調(diào)控細胞遷移等功能。表1所示為目前以Pyk2為靶點的藥物研發(fā)進展［28-29］。

6 結(jié)語

本文從Pyk2的結(jié)構(gòu)域、相關(guān)功能、靶位及其在免疫系統(tǒng)、腫瘤增殖遷移、骨發(fā)育中的作用進行了詳細的闡釋，表明Pyk2主要通過影響骨架蛋白等的相互作用對腫瘤發(fā)生發(fā)展，骨及免疫細胞等的分化遷移發(fā)揮調(diào)控作用。對其功能的詳細了解為其治療侵襲性癌癥，骨質(zhì)疏松癥及炎癥細胞反應(yīng)，依此設(shè)計合理的藥物及指導(dǎo)臨床治療方案提供了理論依據(jù)。

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