NF-κB抑制劑PDTC保護全腦缺血/再灌注大鼠海馬損傷機制涉及COX2-PGI2/TXA2通路的初探

王 佳，楊俊卿，余麗娟，楊 彬，趙 磊，蔣青松

(重慶醫(yī)科大學藥理學教研室，重慶醫(yī)科大學生物化學與分子藥理學重點實驗室，重慶 400016)

缺血性腦血管疾病的死亡率高達30%，是全球?qū)е鲁赡耆擞谰眯詺埣埠退劳龅闹饕蛑唬?］。缺血性腦血管疾病包括全腦缺血和局灶性腦缺血。局灶性腦缺血多為腦栓塞引起，而全腦缺血常見于呼吸心跳驟停、藥物中毒、窒息、休克以及外科手術(shù)中存在的低壓低氧狀況。血液灌流恢復后腦缺血損傷進一步加重，即存在“腦缺血/再灌注損傷”。近10年累積的大量研究資料顯示，腦缺血/再灌注損傷中炎癥的發(fā)展是引發(fā)遲發(fā)性神經(jīng)元死亡的重要因素［2－3］。炎癥過程產(chǎn)生的自由基一方面可以導致自由基損傷，另一方面可與炎性細胞因子一起激活炎癥反應(yīng)，形成炎癥反應(yīng)的惡性循環(huán)。因此通過高位阻斷炎癥通路的級聯(lián)放大可能對減輕神經(jīng)元損傷有利。核轉(zhuǎn)錄因子 κB(nuclear factor-κB，NF-κB)可通過啟動多種炎性基因的轉(zhuǎn)錄參與缺血性腦損傷。已有研究證實NF-κB的抑制劑吡咯烷二硫代氨甲基甲酸鹽 (pyrrolidine dithiocarbamic，PDTC)可以清除活性氧;另一方面，NF-κB為環(huán)氧酶2(cyclooxygenase-2，COX2)的上游調(diào)節(jié)靶點，COX2基因啟動子序列中有2個 NF-κB位點，PDTC可通過抑制 NF-κB而降低 COX2、TNF-α、IL-1β 等的水平，從而產(chǎn)生局灶性腦缺血損傷保護作用［4］。COX2為花生四烯酸代謝生成前列環(huán)素(prostacyclin，PGI2)和血栓素A2(thromboxane A2，TXA2)過程中的關(guān)鍵酶。腦缺血/再灌注后NF-κB和COX2蛋白的高表達可能與海馬神經(jīng)元的遲發(fā)損傷有關(guān)［5］。PGI2/TXA2比例的失調(diào)可促進血小板凝集、微循環(huán)障礙，從而加重缺血/再灌注腦損傷［6］，非甾體抗炎藥對局灶腦缺血/再灌注損傷的保護作用與降低PGI2/TXA2比值有關(guān) 。但是，目前尚未見從COX2-PGI2/TXA2通路來探討PDTC對局灶腦缺血/再灌注損傷保護作用機制的報道;另一方面，由于全腦缺血與局灶腦缺血代表的臨床疾病是不同的，其損傷機制也可能不完全相同，更未見PDTC對全腦缺血/再灌注腦損傷的作用及其機制報道。因此本研究擬通過建立全腦缺血/再灌注大鼠腦損傷模型，觀察PDTC對大鼠全腦缺血/再灌注損傷的影響，并從COX2-PGI2/TXA2通路的改變初步探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組 ♂ SD大鼠，SPF級，200 g～250 g，購自重慶醫(yī)科大學實驗動物中心［動物證書號:SCXK(渝)2010－0001］。SPF環(huán)境飼養(yǎng)3 d。術(shù)前12 h禁食，自由飲水。實驗動物隨機分為4組，即假手術(shù)組、全腦缺血/再灌注組(GCIR組)、PDTC 100 mg·kg－1組(P100組)、PDTC 200 mg·kg－1組(P200組)。每組12 只大鼠。

1.1.2 試劑 PDTC(碧云天生物技術(shù)研究所，S1808)、兔抗 COX-2 多克隆抗體(Santa cruz，SC-1745)、6-keto-PGF1α檢測ELISA試劑盒(Cayman 公司，515211)、TXB2檢測ELISA試劑盒(Cayman公司，519031)。

1.1.3 主要儀器 激光多普勒血流儀(Moor公司;VMS-LDF1型)，Morris水迷宮(中國醫(yī)學科學院藥物研究所)。

1.2 方法

1.2.1 腦血流的測定 大鼠以水合氯醛(400 mg·kg－1，ip)麻醉，剪開頭部皮膚，暴露前囟和頂骨，在前囟向右旁開3 mm，向后下移3 mm處將激光多普勒血流儀的探頭固定于頂骨上，進行全腦缺血/再灌注手術(shù)。激光多普勒血流儀記錄大鼠手術(shù)過程中的腦血流變化，缺血操作時腦血流值下降到其正常血流值40%以下為選入標準。

1.2.2 模型的建立 參照文獻［6，8］的方法，將水合氯醛(400 mg·kg－1，ip)麻醉的大鼠仰臥固定，頸正中切口。分離雙側(cè)頸總動脈與一側(cè)頸總靜脈。由頸總靜脈插管入心房，輸入肝素化生理鹽水。緩慢抽取每只大鼠總血容量體積分數(shù)0.3的血液(大鼠體重不同而血容量也不同)，雙側(cè)頸總動脈夾閉20 min后松開動脈夾，然后緩慢回輸血液，結(jié)扎頸總靜脈，縫合傷口。假手術(shù)組除不進行抽血與夾閉雙側(cè)頸總動脈，其余手術(shù)操作同GCIR。手術(shù)過程中，大鼠體溫保持在(36.5～37.2)℃。

1.2.3 大鼠空間學習記憶能力測試 水迷宮測試分為兩個階段，第1次訓練時將大鼠置于平臺上1 min。后將大鼠分別從A、B、C、D 4個象限背對平臺入水，讓其自由游泳找到隱蔽于水中的平臺，觀察記錄其尋臺潛伏期，180 s內(nèi)未找到平臺者將其尋臺潛伏期記為180 s。訓練4 d，每天4次。第2階段為測試階段，第5天時，撤去平臺，從A，B，C，D 4個象限隨機選定一個位置將大鼠放入水迷宮中，觀察并記錄大鼠尋臺潛伏期作為大鼠記憶成績。

1.2.4 組織病理學檢查 大鼠以水合氯醛(400 mg·kg－1，ip)麻醉，仰臥位固定。剪開胸腔，剝離心包，頭皮針經(jīng)心尖刺入左心室，灌注肝素化生理鹽水，以肝臟作為血液與灌注液出口。注入4%多聚甲醛的磷酸緩沖液進行在體腦組織固定。分離腦組織，4%多聚甲醛固定3 d，腦組織冠狀面切片，切片厚約5 μm，HE染色觀察海馬神經(jīng)元形態(tài)及數(shù)目變化。于10×40視野下隨機選取相應(yīng)區(qū)域10個不重疊視野進行神經(jīng)元細胞計數(shù)。

1.2.5 Western blot測定大鼠海馬COX2蛋白表達提取大鼠海馬蛋白，加入上樣緩沖液煮沸變性。SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，室溫封閉1 h，TBST洗膜10 min×3次，加入 COX2抗體(1∶100)或β-actin(1∶1 000)，4℃過夜，TBST洗膜10 min×3次，辣根酶標記的二抗 (1∶2 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次，ECL化學發(fā)光。以COX2與β-actin的光密度值比值作為COX2蛋白的相對量。

1.2.6 ELISA 測定大鼠海馬 6-keto-PGF1α和 TXB2含量 PGI2和TXA2體內(nèi)迅速被代謝為6-keto-PGF1α和 TXB2，因而測定 6-keto-PGF1α和 TXB2含量。用EIA Buffer將海馬制成10 g·L－1的勻漿液，具體操作按Cayman說明書進行。酶標儀上于405 nm波長處測定吸光度值。

2 結(jié)果

2.1 模型大鼠手術(shù)中腦血流變化 夾閉雙側(cè)頸總動脈前，腦血流灌注量均值為(71.36±4.58)PU，缺血時降為 (19.18±4.47)PU，降幅達到73.12%。夾閉完成后，血流迅速恢復，均值為(78.18±8.06)PU，F(xiàn)ig 1為原始記錄圖。

2.2 PDTC對全腦缺血/再灌注大鼠空間學習記憶能力的影響 水迷宮檢測發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，訓練階段與測試階段中，GCIR組大鼠尋臺潛伏期均明顯延長(P＜0.05)。P100組和P200組大鼠尋臺潛伏期較GCIR組大鼠明顯縮短(Tab 1)。

Tab 1 Effects of PDTC on changes of spatial learning and memory function in global cerebral ischemia reperfusion rats(x±s，n=12)

Fig 1 Dynamic changes of rat cerebral blood flow during GCIR

2.3 大鼠海馬組織病理形態(tài)學變化 假手術(shù)組大鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)清楚完整，細胞排列層次分明。而GCIR大鼠海馬神經(jīng)元出現(xiàn)明顯的核固縮，細胞層次及數(shù)目明顯減少，PDTC預處理組大鼠海馬神經(jīng)元核固縮細胞數(shù)目明顯少于GCIR組(Fig 2)。P100組和P200組大鼠海馬神經(jīng)元死亡率較GCIR組明顯減少，但與假手術(shù)組差異仍有顯著性，P100組和P200組間變化無統(tǒng)計學意義(Fig 3)。

Fig 2 Pathological changes in hippocampus CA1 subfield of rats(×400)

Fig 3Effect of PDTC on decrease of cell death(±s，n=4)

2.4 PDTC對全腦缺血/再灌注大鼠海馬COX2蛋白表達的影響 與假手術(shù)組比較，GCIR組大鼠海馬COX2蛋白表達明顯增加;與GCIR組比較，P100組和P200組大鼠海馬COX2蛋白表達明顯降低，P100組和P200組間則無差異(Fig 4)。

Fig 4Expression of COX2 protein in rat hippocampus(±s，n=4)

2.5 PDTC對全腦缺血/再灌注大鼠海馬6-keto-PGF1α/TXB2的影響 與假手術(shù)組比較，GCIR組大鼠海馬 6-keto-PGF1α、TXB2、6-keto-PGF1α/TXB2比值明顯升高。與GCIR組相比，P100組和P200組6-keto-PGF1α、TXB2、6-keto-PGF1α/TXB2比值明顯降低(Tab 2)。

Tab 2 Effects of PDTC on levels of 6-keto-PGF1α，TXB2 and 6-keto-PGF1α/TXB2in global cerebral ischemia reperfusion rats(±s，n=4)

Tab 2 Effects of PDTC on levels of 6-keto-PGF1α，TXB2 and 6-keto-PGF1α/TXB2in global cerebral ischemia reperfusion rats(±s，n=4)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs sham;#P ＜0.05 vs GCIR

6-keto-PGF1α/μg·g－1tissue TXB2/μg·g－1tissue P/T Sham 32.66 ±9.22 52.86 ±4.47 0.56 ±0.03 GCIR 61.15 ±12.97* 95.43 ±6.82＊＊ 0.71 ±0.06*P100 25.39 ±6.87# 47.73 ±5.77# 0.53 ±0.12#P200 26.24 ±9.62# 50.76 ±5.92# 0.51 ±0.14#

3 討論

PDTC為NF-κB的特異性抑制劑，其通過抑制NF-κB p65亞單位或 I-κB 的降解來抑制 NF-κB 的激活。PDTC最早于1999年用于大鼠體內(nèi)，且劑量高達 200 mg·kg－1時也未發(fā)現(xiàn)明顯的毒性作用［8］?，F(xiàn)在主要用來治療金屬中毒，且已經(jīng)廣泛用于心臟疾病、腦疾病、肺疾病等的研究中，因此PDTC具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。本研究采用100 mg·kg－1和200 mg·kg－1PDTC于全腦缺血/再灌注手術(shù)前1 h腹腔注射，觀察PDTC對全腦缺血/再灌注大鼠海馬損傷及COX2-PGI2/TXA2通路的影響。

本研究結(jié)果表明，PDTC預處理能明顯減輕大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的丟失，使核固縮細胞的數(shù)目減少，明顯改善全腦缺血/再灌注損傷大鼠的空間學習記憶障礙。大量研究證實，COX2參與腦缺血后海馬遲發(fā)型神經(jīng)元死亡［10－11］。本研究結(jié)果顯示，全腦缺血/再灌注后海馬COX2蛋白表達升高，PDTC預處理組大鼠的COX2蛋白表達水平較手術(shù)組大鼠明顯降低，結(jié)果提示PDTC對全腦缺血/再灌注大鼠海馬神經(jīng)元的保護作用可能與抑制COX2的過度表達有關(guān)。

PGI2和TXA2為花生四烯酸的代謝產(chǎn)物?；ㄉ南┧峤?jīng)環(huán)氧酶生成的PGH2，在PGI2合成酶作用下生成PGI2，在TXA2合成酶作用下生成TXA2。研究顯示，腦缺血/再灌注后血漿及大腦皮層中PGI2/TXA2的比值降低，即PGI2合成減少，TXA2合成增多，PGI2/TXA2的比值異常導致微循環(huán)障礙［6］。與此研究不同，我們的前期研究［12］及本研究結(jié)果均發(fā)現(xiàn)全腦缺血/再灌注大鼠海馬PGI2和TXA2均明顯增高，PGI2/TXA2比值明顯上升。PGI2和TXA2明顯增高的機制可能是腦缺血/再灌注后自由基的產(chǎn)生和細胞內(nèi)的鈣超載激活磷脂酶A2，使膜磷脂分解產(chǎn)生大量花生四烯酸，COX2活性增高。與我們研究結(jié)果相似，肝臟移植缺血/再灌注損傷患者血漿中PGI2及 TXA2明顯升高，PGI2/TXA2比值明顯增高［13］;機械性腦損傷腦組織 PGI2及TXA2合成增加，并且 PGI2增加更顯著［14］。也有研究表明［15］，大鼠海馬神經(jīng)元中存在前列環(huán)素合成酶，腦缺血/再灌注時前列環(huán)素合成酶的表達明顯增高。這些結(jié)果提示，全腦缺血/再灌注12 d時大鼠海馬 PGI2/TXA2比值明顯增高是機體對腦缺血/再灌注損傷的代償機制，其對缺血/再灌注腦損傷存在保護作用。我們的實驗研究還發(fā)現(xiàn)，PDTC預處理組大鼠海馬PGI2、TXA2水平及 PGI2/TXA2比值比缺血/再灌注大鼠明顯降低，其機制可能為PDTC抑制NF-κB，高位阻斷了炎癥反應(yīng)的惡性循環(huán)，阻止了PGI2、TXA2合成中的關(guān)鍵酶COX2蛋白表達的異常升高，使PGI2、TXA2及PGI2/TXA2比值恢復正常。

總之，PDTC預處理可減輕全腦缺血/再灌注所致的海馬損傷，其機制可能涉及抑制COX2的表達，進而抑制PGI2、TXA2及PGI2/TXA2比值的異常增高，使PGI2、TXA2及PGI2/TXA2比值恢復至正常水平。

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