金黃地鼠高脂血癥模型膽固醇代謝紊亂的生物標(biāo)志物的研究

康卓穎，初欣欣，楊潤梅，冀 敏，于 瑩，高南南

（1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所藥理毒理研究中心，北京 100193；2.哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，黑龍江哈爾濱 150076）

高脂血癥為一種全身性疾病，是脂質(zhì)代謝或運(yùn)轉(zhuǎn)異常，使血漿一種或多種脂質(zhì)高于正常的病癥。心血管病變的基礎(chǔ)是動(dòng)脈粥樣硬化，而膽固醇和低密度脂蛋白水平升高則是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的直接因素［1］。2011年發(fā)布的健康白皮書《北京市2011年度衛(wèi)生與人群健康狀況報(bào)告》中指出，北京市18～30歲男性的血脂異?；疾÷示谷桓哌_(dá)58.5%，30～40歲男性接近70%。因此，研發(fā)降膽固醇和低密度脂蛋白的新型藥物依然具有十分重要的意義。研究和篩選有效降脂藥物的關(guān)鍵是選擇合適的高脂血癥動(dòng)物模型，即選擇的模型動(dòng)物應(yīng)盡可能地模擬人類脂質(zhì)代謝途徑，并反映人類脂質(zhì)代謝異常的生理病理過程。金黃地鼠脂蛋白結(jié)構(gòu)與人類相似，其肝臟內(nèi)源性膽固醇合成比例約為85%，與人類更為接近［2］，是目前較為公認(rèn)的模型動(dòng)物，但金黃地鼠經(jīng)高脂飼料誘導(dǎo)形成膽固醇代謝紊亂的機(jī)制未見有研究報(bào)道。因此，有必要深入探討該模型膽固醇代謝紊亂的分子機(jī)制，為降膽固醇新藥的研究及其作用靶標(biāo)的篩選提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 金黃地鼠，♂，6～8周齡，體質(zhì)量90～110 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證：SCXK（京）2012-0001。

1.2 高脂飼料 金黃地鼠高脂飼料（15%豬油，0.2%膽固醇，84.8%基礎(chǔ)飼料）購自北京華阜康生物科技股份有限公司，生產(chǎn)許可證：SCXK（京）2009-0008。

1.3 試劑 血清總膽固醇（total cholesterol，TC）批號(hào)：110821、低密度脂蛋白-膽固醇（low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）批號(hào)：120531、甘油三酯（triglyceride，TG）批號(hào)：110541檢測試劑盒，北京中生北控生物科技股份有限公司產(chǎn)品。總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品。

1.4 儀器 日本日立7060型全自動(dòng)生化分析儀；美國BIORAD熒光定量PCR儀；美國General ElectricNano紫外可見蛋白核酸分析儀。

2 方法

將金黃地鼠按隨機(jī)分組原則分為正常對(duì)照組和模型組，正常組飼常規(guī)飼料，模型組飼高脂飼料，12只／組。動(dòng)物飼養(yǎng)在SPF級(jí)環(huán)境［設(shè)施許可證：SYXK（京）2008-0019］。分別于第1、2、3、4周稱量體重，眼眶靜脈叢取血，離心分離血清，檢測血清TC、LDL-C和TG。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)剖取肝臟，用生理鹽水制備肝臟勻漿液，離心取上清液測定肝臟TC、TG含量。制備肝微粒體，檢測膽固醇7α-羥化酶（cholesterol 7 alpha hydroxylase，CYP7A1）活性。Real-time PCR檢測肝臟CYP7A1、肝 X受體 α（liver X receptor alpha，LXRα）、法尼酯受體（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）、肝臟膽固醇 27α-羥化酶（cholesterol 27 alpha hydroxylase，CYP27A1）、低密度脂蛋白受體（low density lipoprotein-receptor，LDL-R）、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-2（sterol regulation element binding protein-2，SREBP-2）mRNA的相對(duì)表達(dá)變化。

2.1 酶法測定肝臟CYP7A1的活性 制備肝臟CYP7A1微粒體，考馬斯亮藍(lán)法測定肝臟CYP7A1微粒體總蛋白含量，按文獻(xiàn)［3］酶法測定肝CYP7A1活性，以每克含CYP7A1酶的微粒體蛋白每分鐘催化膽固醇生成吸光值為1.00的產(chǎn)物（7α羥-4膽固烯-3酮）的相對(duì)量為1個(gè)單位（U）。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測 目前GeneBank數(shù)據(jù)庫沒有金黃地鼠相關(guān)的基因信息，所以利用人類、大鼠、小鼠的保守序列，使用Primer 5軟件設(shè)計(jì)基因引物，并利用Oligo7軟件評(píng)價(jià)引物。PCR引物序列見Tab 1。使用總RNA提取試劑盒按照說明書的步驟提取肝臟組織總RNA，并使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，配置PCR反應(yīng)體系。Real-time PCR的反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性10 s，退火溫度根據(jù)各引物情況而定，40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物以0.5℃／s程序性升溫至95℃，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀自動(dòng)繪制融解曲線。β-actin作為內(nèi)參基因。

Tab 1 PCR primers

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以ˉx±s表示。使用REST?2009軟件對(duì)基因表達(dá)相對(duì)定量進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

3 結(jié)果

3.1 體重觀察 正常組和模型組金黃地鼠體重隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長呈增長現(xiàn)象，于造模第1～4周，模型組體重增長明顯高于正常組（P＜0.01），見 Tab 2。

3.2 血脂變化 模型組金黃地鼠經(jīng)高脂飼料誘導(dǎo)1周，與正常組比較，血清TC、LDL-C和TG即明顯升高，于造模第2～4周一直維持在高水平狀態(tài)，與正常對(duì)照組比較，血清TC分別升高1.67、1.89、1.45、1.44倍（P＜0.01），LDL-C分別升高1.99（P＜0.05）、2.12（P＜0.01）、1.71（P＜0.01）、1.54（P＜0.05）倍，TG分別升高 1.78（P＜0.01）、2.17（P＜0.01）、3.13（P＜0.01）、3.74（P＜0.01）倍，表明形成了具有明顯的高膽固醇、高低密度脂蛋白和高甘油三酯血癥特征的高脂血癥模型，Tab 3。

3.3 肝脂的變化 模型組經(jīng)高脂飼料誘導(dǎo)4周后，肝臟TC和TG濃度明顯升高，TC和TG與正常組比較，分別升高4.20和1.79倍（P＜0.01），形成了肝臟脂肪沉積，Tab 4。

3.4 肝臟CYP7A1活性的變化 金黃地鼠模型組肝臟CYP7A1活性與正常對(duì)照組比較明顯降低（P＜0.05），見Tab 5。

3.5 肝 臟 LDL-R、SREBP-2、CYP7A1、LXRα、FXR、CYP27A1 mRNA基因相對(duì)表達(dá)變化 β-actin作為內(nèi)參基因，對(duì)各基因的擴(kuò)增效率進(jìn)行修正，分析肝臟 LDL-R、SREBP-2、CYP7A1、LXRα、FXR、CYP27A1 mRNA基因相對(duì)表達(dá)的變化。正常對(duì)照組的基因表達(dá)量為1.000，模型組肝臟LDL-RmRNA、SREBP-2 mRNA、CYP7A1 mRNA和LXRαmRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯下調(diào)，分別為0.404±0.248（P＜0.01）、0.508±0.249（P＜0.05）、0.529±0.358（P＜0.01）、0.469±0.252（P＜0.01）。模型組肝臟 FXR mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯上調(diào)，為1.947±0.956（P＜0.05）。CYP27A1 mRNA相對(duì)表達(dá)無明顯變化，F(xiàn)ig 1。

Fig 1 Changes of hepatic LDL-R，SREBP-2，CYP7A1，LXRα，F(xiàn)XR，CYP27A1 mRNA relative expression in hamsters（ˉx±s，n＝12）*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group

Tab 2 Changes of body weight in hamsters（g±s，n＝12）

Tab 2 Changes of body weight in hamsters（g±s，n＝12）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group

Group Before experiment 1 wk 2 wk 3 wk 4 wk Control 100.4±5.4 109.0±6.1 108.4±6.7 108.3±6.4 111.9±7.8 Model 101.4±5.3 115.7±5.3** 115.7±5.5** 117.6±6.1** 119.2±7.2*

4 討論

金黃地鼠經(jīng)高脂飼料誘導(dǎo)后形成了以TC、LDL-C、TG升高為特征的高脂血癥模型，同時(shí)肝脂也明顯升高。本文主要針對(duì)膽固醇代謝紊亂問題進(jìn)行深入探討。根據(jù)前期研究結(jié)果，金黃地鼠膽固醇代謝紊亂環(huán)節(jié)主要集中在膽固醇清除過程中，因此本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)膽固醇清除環(huán)節(jié)中關(guān)鍵的酶、受體、細(xì)胞因子、蛋白變化的研究，闡明金黃地鼠膽固醇代謝紊亂的分子機(jī)制。

肝是降解LDL-C主要器官，由肝臟清除的75%的LDLC，其中90%以上是通過低密度脂蛋白受體（LDL-R）途徑清除［4］，因此血漿中LDL-C水平與LDL-R活性密切相關(guān)。而肝細(xì)胞表面LDL-R活性由肝細(xì)胞內(nèi)膽固醇通過固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-2（SREBP-2）進(jìn)行調(diào)節(jié)［5］。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)膽固醇增加時(shí)，膽固醇與SREBP裂解激活蛋白（sterol-regulatory element binding proteins，SCAP）的固醇敏感結(jié)構(gòu)域（sterol-sensing domain，SSD）結(jié)合，引起 SCAP構(gòu)象發(fā)生變化，從而使SREBP無法與SCAP結(jié)合形成SREBP-SCAP復(fù)合物進(jìn)入高爾基復(fù)合體進(jìn)行裂解［6］，導(dǎo)致SREBP通路被抑制，使LDL-R基因表達(dá)降低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組經(jīng)高脂飼料誘導(dǎo)后，肝臟SREBP-2和LDL-R mRNA表達(dá)下調(diào)，說明肝細(xì)胞為維持細(xì)胞內(nèi)膽固醇穩(wěn)態(tài)，抑制SREBP-2轉(zhuǎn)移至高爾基體，使LDL-R表達(dá)降低，從而阻抑LDL-C通過LDL-R途徑代謝，最終導(dǎo)致血液中LDL-C水平增加。

膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸主要通過兩條途徑：經(jīng)典途徑和替代途徑。經(jīng)典途徑是膽汁酸合成的主要途徑，膽固醇7α-羥化酶（CYP7A1）是決定此過程的限速酶，替代途徑占膽汁酸合成的18%，限速酶為膽固醇27α-羥化酶（CYP27A1），所以CYP7A1的基因表達(dá)量和活性對(duì)膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸的速度起決定作用［7-9］。肝臟法尼酯受體（FXR）與肝 X受體（LXR）分別為CYP7A1的上游轉(zhuǎn)錄抑制因子和轉(zhuǎn)錄激活因子［10］：FXR通過誘導(dǎo)小異二聚體伴侶（short heterodimer partner，SHP）表達(dá)，從而抑制肝受體同系物1（liver receptor homolog-1，LRH-1），阻止LXR激活CYP7A1的表達(dá)，最終減少膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸［11］；LXR存在2種異構(gòu)體，其中LXRα在肝臟中表達(dá)，當(dāng)肝臟膽固醇過多時(shí)，膽固醇的中間代謝產(chǎn)物氧化甾醇也隨之增多，作為LXRα的體內(nèi)配體，氧化甾醇激活LXRα，進(jìn)而上調(diào)CYP7A1，最終促進(jìn)膽固醇向膽汁酸轉(zhuǎn)化［12-13］。本實(shí)驗(yàn)中金黃地鼠模型組肝臟FXR mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，LXRαmRNA表達(dá)明顯下調(diào)，CYP7A1活性和基因表達(dá)與對(duì)照組相比明顯降低，CYP27A1 mRNA的相對(duì)表達(dá)沒有明顯變化，說明金黃地鼠經(jīng)高脂飼料誘導(dǎo)后，肝臟FXR被激活，LXRα受到抑制，從而使CYP7A1表達(dá)下調(diào)及活性降低，使固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸的經(jīng)典合成途徑受到抑制，導(dǎo)致膽固醇代謝紊亂。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，金黃地鼠經(jīng)高脂飼料誘導(dǎo)短期內(nèi)即可形成高脂血癥模型，該模型具有造模周期短，高脂血癥明顯的特點(diǎn)。其膽固醇代謝紊亂的機(jī)制主要為：（1）肝臟SREBP-2表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而抑制LDL-R的表達(dá)，使LDL-C通過LDL-R進(jìn)行降解的通路受到阻抑，最終引起血液LDL-C水平增加。（2）肝臟 FXR表達(dá)上調(diào)，LXRα下調(diào)，從而使CYP7A1活性和基因表達(dá)下調(diào)，繼而抑制膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸的經(jīng)典合成途徑，導(dǎo)致膽固醇分解速率減慢，血液TC濃度明顯升高。LDL-R、SREBP-2、CYP7A1、FXR和 LXRα的改變是金黃地鼠高脂血癥模型膽固醇代謝紊亂形成的分子機(jī)制，它們也是抗高膽固醇血癥藥物的作用靶標(biāo)判斷的生物標(biāo)志物。

Tab 3 Changes of serum TC，LDL-C，TG concentration in hamsters（±s，n＝12）

Tab 3 Changes of serum TC，LDL-C，TG concentration in hamsters（±s，n＝12）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group

Index Time／wk Control Model TC／mmol·L-1 1 3.14±0.53 5.24±1.05**2 2.96±0.40 5.60±0.87**3 3.34±0.60 4.83±1.02**4 3.31±0.70 4.75±0.57**LDL-C／mmol·L-1 1 0.82±0.68 1.63±0.89*2 0.85±0.35 1.80±0.74**3 0.76±0.25 1.30±0.48**4 0.77±0.22 1.19±0.43*TG／mmol·L-1 1 1.51±0.54 2.69±0.84**2 1.17±0.67 2.54±0.92**3 0.89±0.10 2.79±1.40**4 1.31±0.52 4.91±1.53**

Tab 4 Changes of liver TC and TG concentration in hamsters（±s，n＝12）

Tab 4 Changes of liver TC and TG concentration in hamsters（±s，n＝12）

**P＜0.01 vs control group

Group TC／mg·g-1 TG／mg·g-1 Control 0.15±0.09 0.56±0.15 Model 0.63±0.30** 1.00±0.33**

Tab 5 Changes of hepatic CYP7A1 in hamsters±s，n＝12）

Tab 5 Changes of hepatic CYP7A1 in hamsters±s，n＝12）

*P＜0.05 vs control group

Group CYP7A1／U·g-1 Control 21.75±4.93 Model 16.18±2.08*

參考文獻(xiàn)：

［1］ Fontbonne A，Eschwège E，Cambien F，et al.Hypertriglyceridaemia as a risk factor of coronary heart disease mortality in subjects with impaird glucose tolerance or diabetes［J］.Diabetologia，1989，32（5）：300-4.

［2］ Dietschy J M，Turley SD，Spady D K.Role of liver in the maintenance of cholesterol and low density lipoprotein homeostasis in different animal species including humans［J］.J Lipid Res，1993，34（10）：1637-59.

［3］ Fernandez M L，Sun D M，Tosca M，et al.Guar gum effects on plasma low-density lipoprotein and hepatic cholesterol metabolism in guinea pigs fed low-and high-cholesterol diets：a dose-response study［J］.Am J Nut，1995，61（1）：127-34.

［4］ Jeon H，Blacklow S C.Structure and physiologic function of the low-density lipoprotein receptor［J］.Annu Rev Biochem，2005，74：535-62.

［5］ Wong J，Quinn C M，Brown A J.SREBP-2 positively regulates transcription of the cholesterol efflux gene，ABCA1，by generating oxysterol ligands for LXR［J］.Biochem J，2006，400（3）：485-91.

［6］ 杜 嬈，謝梅林.SREBPs的調(diào)節(jié)及在非酒精性脂肪肝形成機(jī)制中的研究進(jìn)展［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2009，25（11）：1412-5.

［6］ Du R，Xie M L.Regulation of SREBPs and its research progress in the development of nonalcoholic fatty liver［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25（11）：1412-5.

［7］ Schwarz M，Russell D W，Dietschy JM，et al.Alternate pathways of bile acid synthesis in the cholesterol 7 alpha-hydroxylase knockout mouse are not upregulated by either cholesterol or cholestyramine feeding［J］.J Lipid Res，2001，42（10）：1594-603.

［8］ Twisk J，de Wit E C，Princen H M.Suppression of sterol 27-hydroxylase mRNA and transcriptional activity by bile acids in cultured rat hepatocytes［J］.Biochem J，1995，305（Pt2）：505-11.

［9］ Nilsson LM，Abrahamsson A，Sahlin S，et al.Bile acids and lipoprotein metabolism：effects of cholestyramine and chenodeoxycholic acid on human hepatic mRNA expression［J］.Biochem Biophys Res Commun，2007，357（3）：707-11.

［10］Rader D J.Liver X receptor and farnesoid X receptor as therapeutic targets［J］.Am J Cardiol，2007，100（11A）：n15-9.

［11］Lambert G，Amar M J，Guo G，et al.The farnesoid X-receptor is an essential regulator of cholesterol homeostasis［J］.J Biol Chem，2003，278（4）：2563-70.

［12］John G，Menke L，Macnaul S，et al.A novel liver X receptor agonist establishes species differences in the regulation of cholesterol 7α-hydroxylase［J］.Endocrinology，2002，143（7）：2548-58.

［13］宋 鑫，高南南，楊潤梅，等.豚鼠高脂血癥模型LDL-C代謝紊亂的機(jī)制研究［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2012，28（3）：342-6.

［13］Song X，Gao NN，Yang R M，et al.Mechanism of hyperlipidemic LDL-C metabolic disorder in the guinea pig［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28（3）：342-6.