莫西沙星聯(lián)合頭孢哌酮／舒巴坦對耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌防耐藥突變濃度的研究

張欣悅，孫成春，公衍文，楊傳偉，劉 穎

（1.遼寧醫(yī)學(xué)院研究生院，遼寧錦州121001；2.濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科，山東濟(jì)南 250031；3.濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院實驗診斷科，山東 濟(jì)南 250031；4.山東明仁福瑞達(dá)制藥股份有限公司研發(fā)部，山東 濟(jì)南 250104；5.天津藥物研究院，天津 300100）

鮑曼不動桿菌為非發(fā)酵革蘭陰性桿菌，主要引起呼吸道感染、敗血癥、泌尿系統(tǒng)感染、繼發(fā)性腦膜炎等。近年來研究表明，鮑曼不動桿菌在醫(yī)院感染中占第4位，已成為醫(yī)院感染的重要病原菌，并有逐年升高的趨勢［1］。由于碳青霉烯類藥物治療鮑曼不動桿菌感染的療效較好，在醫(yī)院感染的治療中被廣泛使用，使得耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌（Carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii，CRAB）越來越多，給臨床治療帶來很大困難，已引起臨床和微生物學(xué)者的嚴(yán)重關(guān)注［2］。

Drlica等［3］提出的防突變濃度（mutant prevention concentration，MPC）和突變選擇窗（mutant selection window，MSW）理論，為有效抑制細(xì)菌耐藥及制定應(yīng)對策略提供了新的思路和參考依據(jù)。該理論是指最低抑菌濃度（MIC）到 MPC之間的范圍。MPC是防止耐藥突變菌株被選擇性富集擴(kuò)增所需的最低抗菌濃度，也是評價抗菌藥物防耐藥能力的新指標(biāo)?；谠摾碚?，當(dāng)兩種或以上藥物聯(lián)合應(yīng)用時，細(xì)菌需要同時突變兩次或多次才能產(chǎn)生突變菌株，但這種概率非常低，從而使MSW縮小或關(guān)閉。目前關(guān)于MFX聯(lián)合CFS對CRAB的MPC的影響研究尚未見報道。本研究通過體外MFX聯(lián)合CFS對CRAB的MPC影響，探討抗菌藥物聯(lián)用降低MPC、縮小MSW的規(guī)律，為臨床合理使用有限的抗菌藥物、防止突變菌株的出現(xiàn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 抗菌藥物與培養(yǎng)基 莫西沙星（0.4 g／片，拜耳醫(yī)藥保健有限公司）；頭孢哌酮（cefoperazone，批號：30420-200304，含量：96.5%）、舒巴坦（sulbactam，批號：30430-200305，含量：89.2%）均購自中國藥品生物制品檢定所。M-H肉湯粉和M-H瓊脂平板培養(yǎng)基均購自英國Oxiod公司。

1.2 菌株來源與鑒定 選擇我院2010年1月～2012年8月臨床標(biāo)本中分離的20株CRAB。質(zhì)控菌為銅綠假單胞菌ATCC27853。經(jīng)VITEK-2分析儀鑒定，采用紙片擴(kuò)散法（Kirby-Bauer法）進(jìn)行藥敏試驗，選取對亞胺培南或美羅培南耐藥的鮑曼不動桿菌20株。

1.3 實驗儀器 電熱恒溫培養(yǎng)箱（山東濰坊精鷹醫(yī)療器械有限公司）；Vitek比濁儀、VITEK-2全自動微生物分析儀（法國生物梅里埃公司）；XK 96-3型微量振蕩器（姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司）；-80℃超低溫冰箱（SANYO Electric Co.Ltd.）。

1.4 最低抑菌濃度的測定

1.4.1 測定單獨應(yīng)用時的MIC 采用微量肉湯稀釋法測定MFX和CFS分別使用時的MIC，并按美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（CLSI）2012年標(biāo)準(zhǔn)［4］判斷結(jié)果。

1.4.2 測定MFX和CFS聯(lián)合應(yīng)用時的MIC 采用簡化棋盤法［5］測定MFX和CFS聯(lián)用時的MIC。

1.4.3 計算部分抑菌濃度（fractional inhibitory concentration，F(xiàn)IC）指數(shù)及判定標(biāo)準(zhǔn) FIC指數(shù) ＝MIC甲藥聯(lián)用／MIC甲藥單用+MIC乙藥聯(lián)用／MIC乙藥單用。判定標(biāo)準(zhǔn)：FIC指數(shù)≤0.5，協(xié)同作用；0.5～1，相加作用；1～2，無關(guān)作用；FIC＞2，拮抗作用。

1.5 防耐藥突變濃度（MPC）的測定［6-7］

1.5.1 含單藥瓊脂平板的配制 采用瓊脂平板倍比稀釋法測定抗菌藥物對20株CRAB的 MPC。MFX和CFS的藥物濃度范圍分別為0.125～512 mg·L-1和2～512 mg·L-1。每個濃度配制4個平板作為平行對照。

1.5.2 含兩藥瓊脂平板的配制 以MFX和CFS的MIC、MPC為基準(zhǔn)，采用二倍稀釋法配制含MFX與CFS混合的系列不同濃度梯度瓊脂平板。最低濃度為MFX和CFS的單藥MIC，最高濃度為MFX和CFS的單藥MPC，每個濃度4個平板。

1.5.3 菌懸液制備 從新鮮過夜培養(yǎng)的細(xì)菌平板上挑取單個菌落接種于20 ml MH肉湯中37℃震蕩過夜培養(yǎng)，3 000 r·min-1離心后棄上清，再懸浮在200 ml MH肉湯中，震蕩培養(yǎng)6 h，3 000 r·min-1離心，棄上清，調(diào)整菌液濃度為3×1013CFU·L-1。

1.5.4 MPC的測定 取100μl 3×1013CFU·L-1菌液均勻涂布于含不同濃度藥物的MH平板上，每個濃度4個平板。（35±2）℃培養(yǎng)72 h，以4個平板均無細(xì)菌生長的最低藥物濃度為MPC。對含單藥瓊脂平板的測定為單藥MPC，對含兩藥瓊脂平板的測定即為聯(lián)合用藥后的MPC。對接近MPC藥物濃度篩選出來的菌株接種于無藥物的MH平皿，傳代兩次后，再接種于原篩選藥物濃度的平板上，以確定其是耐藥突變株。以上實驗重復(fù)兩次，取其平均值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行配對秩和檢驗分析。

Tab 1 Accumulative inhibitory rate of MIC（mg·L-1）for 2 antimicrobial agents against 20 strains of CRAB

2 結(jié)果

2.1 抗菌藥物對20株CRAB的MIC值 MFX和CFS對20株CRAB的MIC范圍分別為：0.125～2 mg·L-1、8～32 mg·L-1，見 Tab 1。

2.2 聯(lián)合藥敏 MFX與CFS聯(lián)用后，協(xié)同作用所占的比例為0.45（9／20），相加所占的比例為0.35（7／20），無關(guān)作用所占的比例為 0.20（4／20），未見拮抗作用，以協(xié)同和相加作用為主。

2.3 抗菌藥物單用及聯(lián)合使用對CRAB的MPC和SI值 MFX、CFS單用對20株CRAB的MPC范圍分別為4～64 mg·L-1、128～256 mg·L-1；MFX、CFS聯(lián)合使用后，兩者對20株CRAB的MPC范圍分別為：0.5～4 mg·L-1、64～128 mg·L-1。MFX、CFS單用對20株CRAB的選擇指數(shù)（selectiveity index，SI＝MPC／MIC）分別為：4～128、8～64；MFX、CFS聯(lián)合使用后兩者對20株CRAB的SI分別為：1～8、4～16，見 Tab 2。

3 討論

鮑曼不動桿菌是一種臨床常見和重要的醫(yī)院感染病原菌。近年來，隨著臨床治療中碳青霉烯類抗生素濫用現(xiàn)象的日益普遍，該菌對此類藥物的耐藥性明顯增強(qiáng)［8］，已成為當(dāng)今醫(yī)院感染最為棘手的問題之一。

目前臨床應(yīng)用的MIC給藥策略，在抑制或殺滅敏感菌的同時，使耐藥突變菌得到富集擴(kuò)增，導(dǎo)致治療失敗。MSW理論［9］表明：當(dāng)藥物濃度高于 MPC時，病原菌必須突變兩次或更多次才能生存，而這種突變的概率非常低。豆梅琴等［10］通過測定氟喹諾酮類抗菌藥物的MPC，認(rèn)為當(dāng)其濃度高于MPC時，可有效防止鮑曼不動桿菌耐藥突變體的產(chǎn)生。這與本文MFX單用所測MPC相吻合。結(jié)合文獻(xiàn)［11］報道的MFX最大血藥濃度 Cmax（4.5 mg·L-1），本試驗表明：單用MFX，藥物濃度往往落在MSW內(nèi)，易產(chǎn)生耐藥。若要增大MFX的給藥劑量，可能會給患者帶來更嚴(yán)重的風(fēng)險，可見單用MFX并不能產(chǎn)生理想療效。

MSW理論表明：當(dāng)兩種不同作用機(jī)制的抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用，并同時處于各自的MIC以上時，細(xì)菌很難同時產(chǎn)生兩種耐藥突變，使其MSW關(guān)閉或縮小，從而達(dá)到防止耐藥菌產(chǎn)生及減少不良反應(yīng)的目的。Cai等［12］報道了多粘菌素聯(lián)合左氧氟沙星或妥布霉素可縮小其對多耐藥鮑曼不動桿菌的MSW，防止對多粘菌素耐藥的菌株出現(xiàn)。本研究的體外聯(lián)合藥敏結(jié)果顯示，MFX聯(lián)合CFS主要表現(xiàn)為協(xié)同和相加作用，無拮抗作用。因此兩藥聯(lián)用，可增強(qiáng)抑菌效果。結(jié)合藥代動力學(xué)參數(shù)分析，MFX單用時，其MPC大部分高于Cmax，聯(lián)合CFS后，MPC明顯降低到Cmax以下，有效的限制了耐藥菌株的產(chǎn)生；對于CFS，頭孢哌酮和舒巴坦的平均血清峰濃度分別為236.8 mg·L-1和130.2 mg·L-1。同 MFX一樣，聯(lián)合使用后，CFS的MPC降到Cmax以下。可見，將臨床常用的MFX和CFS聯(lián)合后，各自MPC明顯降低，使其藥物濃度高于MPC，進(jìn)而有效防止耐藥菌株的產(chǎn)生；該實驗還表明，將MFX與CFS聯(lián)合使用，SI較其單用均有明顯下降。再次證實了聯(lián)用不同作用機(jī)制的抗菌藥物可減少耐藥菌的產(chǎn)生，獲得良好的療效。

本研究對MFX聯(lián)合CFS在治療CRAB感染方面進(jìn)行了初步探討，為臨床合理使用現(xiàn)有抗菌藥物、防止耐藥菌產(chǎn)生提供了一定的理論指導(dǎo)和支持。由于體內(nèi)藥物濃度不斷變化，影響因素復(fù)雜，聯(lián)合用藥時的藥代動力學(xué)相關(guān)參數(shù)與耐藥突變體富集的關(guān)系仍需進(jìn)行相關(guān)的體內(nèi)研究。

（致謝：本文在統(tǒng)計方面得到了濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院于莉莉博士的指導(dǎo)和幫助，在此一并感謝?。?/p>

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