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    水楊酸鈉對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元電壓門(mén)控性鈣離子通道的影響

    2014-05-18 08:08:23朱小麗劉硯星種寶貴馬紅芳張曉燕
    關(guān)鍵詞:水楊酸鈉腦片邊緣系統(tǒng)

    朱小麗,劉硯星,種寶貴,馬紅芳,江 平,張曉燕

    (1.河北醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室,河北省新藥藥理毒理研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北石家莊 050017;2.河北省哈勵(lì)遜國(guó)際和平醫(yī)院,河北衡水 053000)

    耳鳴是一種常見(jiàn)的聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)疾病,其特點(diǎn)是在無(wú)外部相應(yīng)聲源的情況下耳內(nèi)出現(xiàn)的幽靈般的鈴音或蜂鳴聲,是一種主觀的聲音感覺(jué)[1]。大量研究顯示水楊酸鈉會(huì)導(dǎo)致耳鳴[2-4],因此水楊酸鈉成為研究耳鳴發(fā)生機(jī)制的重要工具藥。Liu等[5]通過(guò)觀察水楊酸鈉對(duì)顳皮層上延遲整流鉀離子通道的影響,證實(shí)了耳鳴與聽(tīng)覺(jué)中樞有關(guān)。耳鳴通常伴隨失眠、厭煩等不良情緒,許多臨床醫(yī)生已經(jīng)注意到了耳鳴和情緒狀態(tài)之間的聯(lián)系[6]。影像學(xué)研究已證實(shí),耳鳴和抑郁癥之間存在激活的神經(jīng)回路,噪音創(chuàng)傷后耳鳴的動(dòng)物模型和抑郁癥的動(dòng)物模型都伴有海馬神經(jīng)元的損傷[7]。實(shí)際上認(rèn)知行為療法對(duì)某些耳鳴患者是有效的[8]。這些耳鳴和情緒反應(yīng)之間的聯(lián)系使一些學(xué)者提出邊緣系統(tǒng)參與耳鳴不良情緒的形成這一觀點(diǎn)[9]。Mirz等[10]利用 PET技術(shù)對(duì) 8名耳鳴患者和8名健康志愿者進(jìn)行對(duì)比,發(fā)現(xiàn)患者的右前額葉、右顳葉腦區(qū)的腦血流量明顯增加,同時(shí)左半腦區(qū)的邊緣系統(tǒng)的杏仁核部位的腦血流量也有所增加。同時(shí),Mirz等[11]還對(duì)12名健康志愿者進(jìn)行研究,利用噪音來(lái)模擬耳鳴的心理聲學(xué)特征及其對(duì)患者造成的情感反應(yīng),再利用PET檢測(cè)大腦局部血流分布的改變。該研究發(fā)現(xiàn)這些聲音刺激引起初級(jí)聽(tīng)皮層、次級(jí)聽(tīng)皮層、背外側(cè)額葉以及與情感相關(guān)的邊緣系統(tǒng)腦血流的增加,證明邊緣系統(tǒng)可能與耳鳴的感知和情緒產(chǎn)生有關(guān)。Lockwood等[12]應(yīng)用PET研究大腦的代謝活動(dòng),通過(guò)觀察大腦對(duì)去氧葡萄糖的攝取情況,發(fā)現(xiàn)耳鳴患者不僅Brodmann41區(qū)域(即原始聽(tīng)區(qū)域)的代謝活動(dòng)增強(qiáng),邊緣系統(tǒng)也出現(xiàn)異常的代謝活動(dòng),聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)和邊緣系統(tǒng)間存在著異常構(gòu)成聯(lián)系,耳鳴與顳橫回、顳上回、顳下回及海馬等腦區(qū)的活動(dòng)有關(guān)。同時(shí),他還用15O標(biāo)記的H215O作為示蹤劑,通過(guò)PET觀察了4例均能通過(guò)口面隨意運(yùn) 動(dòng) (performing voluntary oral facial movements,OFM)改變耳鳴響度的耳鳴患者,在其靜息狀態(tài)、口面活動(dòng)期間及給予聲音信號(hào)時(shí)的腦血流變化,發(fā)現(xiàn)耳鳴響度增加時(shí)對(duì)側(cè)聽(tīng)皮層腦血流增加,而且聲音信號(hào)在耳鳴患者腦內(nèi)引起腦活動(dòng)的區(qū)域比正常人更廣泛,它包括初級(jí)聽(tīng)皮層、島葉、海馬、邊緣系統(tǒng)、丘腦等,同時(shí)還觀察到聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)與海馬存在著異常聯(lián)系,為邊緣系統(tǒng)參加耳鳴感覺(jué)形成的推論提供了依據(jù)[12]。有研究顯示興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸[12]和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸[13]與耳鳴的形成關(guān)系密切,而電壓門(mén)控性鈣通道(voltage-gated calcium channels,VGCC)與神經(jīng)遞質(zhì)釋放及激素分泌密切相關(guān)[11]。所以,本研究利用腦片膜片鉗技術(shù),觀察水楊酸鈉對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元電壓門(mén)控性鈣離子通道電生理學(xué)特性的影響。

    1 材料與方法

    1.1 腦片制備 選用健康14 d齡的SD大鼠,快速斷頭,掀開(kāi)顱骨,完全斷開(kāi)腦神經(jīng),完整剝離出全腦,使腦組織在0~4℃預(yù)先氧飽和(95%O2+5%CO2)的人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid,ACSF)中冷卻。按冠狀切面修整剝離出的全腦,用濾紙吸干表面的ACSF,用氰丙烯酸鹽膠垂直粘在切片機(jī)上已事先固定好的瓊脂制標(biāo)本托上。將標(biāo)本槽快速充滿(mǎn)0~4℃預(yù)先氧飽和(95%O2+5%CO2)的ACSF,使全腦浸埋其中,并持續(xù)通氣。將其用振動(dòng)切片機(jī)切成300μm厚的腦片,然后將腦片移至孵育槽內(nèi),持續(xù)通氣,在溫度為(30~32)℃下,孵育1 h。

    ACSF:NaCl 119, MgCl21.3, KCl 5.4,NaH2PO4·2H2O 1,NaHCO326.2,D-Glucose 11,CaCl22.5,濃度單位為 mmol·L-1,pH值調(diào)節(jié)至7.35~7.40,并用0.22μm孔徑的微孔濾膜濾過(guò)。

    1.2 全細(xì)胞膜片鉗記錄 將孵育好的腦片置于灌流槽中,浸沒(méi)于液面下約3~4 mm。用蓋網(wǎng)固定法固定腦片,用氧飽和的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞外液進(jìn)行持續(xù)灌流,流速約為3 ml·min-1。利用紅外微分干涉相差顯微鏡,通過(guò)圖像采集軟件成像于計(jì)算機(jī)監(jiān)視器屏幕上,觀察并選擇狀態(tài)良好的海馬神經(jīng)元進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將硬質(zhì)有芯玻璃毛坯管拉制成電阻為4~6Ω的玻璃微電極,從微電極尾部充灌電極內(nèi)液,然后通過(guò)微電極操縱器引導(dǎo)電極到達(dá)記錄部位,到達(dá)記錄部位后釋放正壓、給予負(fù)壓,形成高阻抗(>1 GΩ)封接,再繼續(xù)施以負(fù)壓吸破細(xì)胞膜,形成全細(xì)胞記錄模式。

    ICa的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞外液:TEA 140,CsCl 5,HEPES 10,D-Glucose 11,BaCl25,MgCl21,TTX 0.01.濃度單位均為mmol·L-1,將pH值調(diào)至7.35,并用孔徑為0.22μm的微孔濾膜濾過(guò)。

    ICa的電極內(nèi)液:CsCl 110,HEPES 10,EGTA 10,TEA 30,Mg-ATP 5,Na-GTP 0.3,濃度單位均為mmol·L-1,將pH值調(diào)至7.2,并用孔徑為0.22 μm的微孔濾膜濾過(guò)。

    1.3 給藥方式 以標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞外液為溶媒,配制不同濃度的水楊酸鈉溶液。采取灌流方式給藥。

    1.4 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析 采用EPC-10軟件(HECK公司)收集所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),采用Origin 7.5軟件分析數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用ˉx±s表示。采用配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組數(shù)據(jù)間的比較。

    2 結(jié)果

    2.1 水楊酸鈉對(duì)海馬神經(jīng)元鈣電流的抑制作用鉗制電壓-50 mV,給以10 mV持續(xù)200 ms的去極化脈沖得到的電流即ICa。采用灌流法給予不同濃度(分別為 0.1、0.3、1、3、10 mmol·L-1)的水楊酸鈉,觀察水楊酸鈉對(duì)ICa的影響。以水楊酸鈉作用的效應(yīng)率為縱坐標(biāo),水楊酸鈉的濃度為橫坐標(biāo)作圖,得到濃度 -效應(yīng)關(guān)系曲線(Fig 1)。加入0.1、0.3、1、3、10 mmol·L-1的水楊酸鈉后,ICa幅度分別減小為加藥前的(94.56±1.07)%、(84.48±1.02)%、(63.39±1.37)%、(40.47±3.57)%、(23.42 ±3.90)%。按照Hill方程對(duì)濃度-效應(yīng)關(guān)系進(jìn)行擬合。擬合后的濃度-效應(yīng)曲線的半抑制濃度IC50為1.64 mmol·L-1,Hill系數(shù)h為0.22。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,水楊酸鈉對(duì)ICa有抑制作用,而且這種抑制作用具有劑量/濃度依賴(lài)性。本實(shí)驗(yàn)的水楊酸鈉的實(shí)驗(yàn)濃度選為1 mmol·L-1。

    Fig 1 Dose response inhibition of sodium salicylate on I Ca

    Fig 2 Effect of 1mmol·L-1 salicylate on the I-V relationship of peak I CaA:Original current traces of control I Ca;B:Original current traces of I Ca after 1 mmol·L-1 salicylate application;C:Peak I-V curves for control and 1 mmol·L-1 salicylate.*P<0.05,**P<0.01 vs control.

    Fig 3 Effect of 1 mmol·L-1 salicylate on the steady-state activation curve of I Ca

    鉗制電壓-50 mV,給以 -50~+40 mV持續(xù)200 ms,階躍為10mV的一系列去極化測(cè)試脈沖,刺激頻率為0.1 Hz,可以記錄到一系列ICa。

    以電流的峰值/膜電容(pA/pF)為縱坐標(biāo),以相對(duì)應(yīng)的電壓為橫坐標(biāo)作圖,即得到ICa的電流密度-電壓曲線。Fig 2A和 Fig 2B分別顯示給藥前和給藥后的原始電流圖。Fig 2C顯示1 mmol·L-1水楊酸鈉使ICa的幅度減小,對(duì)其有抑制作用。而且,加藥前,ICa在-50 mV左右開(kāi)始激活,在-30 mV到達(dá)到峰值,然后逐漸減小,到+25 mV翻轉(zhuǎn)成外向電流。給藥后,ICa也是在-50 mV左右開(kāi)始激活,在-40 mV左右達(dá)到峰值,然后逐漸減小,到+25 mV翻轉(zhuǎn)成外向電流。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得到1 mmol·L-1水楊酸鈉使ICa的I-V曲線的峰值電壓向超級(jí)化方向移動(dòng)10 mV,但是不改變其翻轉(zhuǎn)電位。

    2.2 水楊酸鈉對(duì)海馬神經(jīng)元鈣電流的穩(wěn)態(tài)激活曲線的影響 鉗制電壓-50 mV,給以-50~-10 mV,持續(xù)200 ms,階躍為10 mV的一系列去極化脈沖,刺激頻率為0.1 Hz。將每次電流的峰值轉(zhuǎn)化為電導(dǎo)值,以歸一化的電導(dǎo)值為縱坐標(biāo),相對(duì)應(yīng)的膜電位為橫坐標(biāo),作圖。用最小二乘法,按照Boltzmann方程進(jìn)行曲線擬合。得到穩(wěn)態(tài)激活曲線(Fig 3)。在加藥前半激活電壓V1/2為(-23.52±0.50)mV,斜率k為(2.43±0.29)。給藥后半激活電壓V1/2為(-32.19±1.45)mV(P<0.05,n=8),斜率k為(2.30±1.31)(P>0.05,n=8)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,1 mmol·L-1水楊酸鈉使ICa的穩(wěn)態(tài)激活曲線向超極化方向移動(dòng)大約9 mV,但是曲線的斜率并不改變。

    2.3 水楊酸鈉對(duì)海馬神經(jīng)元穩(wěn)態(tài)失活曲線的影響鉗制電壓 -50 mV,給以 -70~+10 mV,持續(xù)2 000 ms,階躍為10 mV的一系列條件脈沖,然后給予去極化至+10 mV,持續(xù)200 ms的測(cè)試脈沖,刺激頻率為0.1 Hz。以電流峰值的相對(duì)值(I/Imax)為縱坐標(biāo),相對(duì)應(yīng)的條件脈沖為橫坐標(biāo)作圖,再利用最小二乘法,按照Boltzmann方程進(jìn)行擬合,得到ICa的穩(wěn)態(tài)失活曲線(Fig 4)。加藥前,半失活電壓 V1/2為(-23.71±1.21)mV,斜率 k為(8.35±1.14);給藥后,半失活電壓 V1/2為(23.08±0.71)mV(P>0.05,n=8),斜率 k為(9.43±0.68)(P>0.05,n=8)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,1 mmol·L-1水楊酸鈉既不使ICa的穩(wěn)態(tài)失活曲線向去極化方向移動(dòng),也不向超極化方向移動(dòng),也不改變其斜率。

    3 討論

    鈣電流是細(xì)胞動(dòng)作電位的重要電流,在形成動(dòng)作電位的平臺(tái)期方面起重要作用。VGCC開(kāi)放,大量Ca2+內(nèi)流使神經(jīng)遞質(zhì)釋放增多[13]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,水楊酸鈉對(duì)ICa有抑制作用,且這種作用具有濃度依賴(lài)性。Taggart[14]在研究水楊酸鈉的安全用藥劑量時(shí)發(fā)現(xiàn),水楊酸鈉導(dǎo)致耳鳴的發(fā)病率與水楊酸鈉的血藥濃度成正比,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與他的研究結(jié)論一致。本實(shí)驗(yàn)還顯示,1 mmol·L-1水楊酸鈉會(huì)改變ICa的激活動(dòng)力學(xué)特征,使ICa的穩(wěn)態(tài)激活曲線向超級(jí)化方向移動(dòng)大約9 mV,但是不改變其失活動(dòng)力學(xué)特征。水楊酸鈉的抑制作用可能是因?yàn)樗芘c海馬部位神經(jīng)元上的VGCC的靜息態(tài)和激活態(tài)相結(jié)合。

    Brozoski等[15]用高分辨率質(zhì)子磁共振波譜技術(shù)觀察噪音導(dǎo)致耳鳴的大鼠,發(fā)現(xiàn)下丘和聽(tīng)皮層的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸含量增多,而抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸含量減少。Liu等[16]利用微透析技術(shù)觀察到水楊酸鈉使豚鼠下丘和顳皮層的葡萄糖和乳酸含量增高,同時(shí)觀察到5-羥色胺含量也增高。大鼠暴露在噪音中4個(gè)月后,檢測(cè)到甘氨酸受體β亞基的含量減少[17]。我們推測(cè)興奮性氨基酸釋放的增多、抑制性氨基酸釋放的減少可能是水楊酸鈉對(duì)神經(jīng)元上各種電壓門(mén)控性離子通道的綜合作用的結(jié)果。這是因?yàn)樗鼘?duì)電壓門(mén)控性鉀通道和鈉通道的抑制會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)釋放的增多,而它對(duì)電壓門(mén)控性鈣通道的抑制會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)釋放的減少。本試驗(yàn)結(jié)果只顯示了海馬神經(jīng)元上某種離子通道的總體的變化情況,并未對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行詳細(xì)劃分(例如分為興奮性和抑制性神經(jīng)元兩大類(lèi)),所以若想弄清水楊酸鈉對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)影響不同的確切原因,還有待于進(jìn)一步研究。

    本部分實(shí)驗(yàn)利用腦片膜片鉗技術(shù)研究了水楊酸鈉對(duì)海馬部位神經(jīng)元上的VGCC的影響。水楊酸鈉抑制ICa的幅度,且這種抑制作用具有濃度依賴(lài)性,使穩(wěn)態(tài)激活曲線向超級(jí)化方向移動(dòng),導(dǎo)致海馬神經(jīng)元的神經(jīng)遞質(zhì)減少。研究結(jié)果顯示,水楊酸鈉對(duì)海馬神經(jīng)元上的VGCC有明顯影響,這可能與耳鳴不良情緒的產(chǎn)生相關(guān)。

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