α突觸核蛋白作用核苷酸序列的體外篩選研究

馬開(kāi)利，宋連昆，苑玉和，張 瑩，李 莉，楊金玲，朱 平，陳乃宏

（1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院·北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，天然藥物活性物質(zhì)與功能?chē)?guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新藥作用機(jī)制研究與藥效評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，藥理學(xué)研究室，北京 100050；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院·北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南昆明 650118）

α突觸核蛋白（α-synuclein，α-syn）最早發(fā)現(xiàn)其定位于突觸前末端及細(xì)胞核［1］，隨后的大量研究表明，α-syn的核定位存在于包括培養(yǎng)的細(xì)胞［2-3］、αsyn轉(zhuǎn)基因果蠅［4］及小鼠［5］在內(nèi)的各種實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)內(nèi)。近來(lái)的研究表明，α-syn的核定位可能在帕金森病的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。Zhou等［6］的研究表明，α-syn的核轉(zhuǎn)位增加能夠引起多巴胺能細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的敏感性增加。Boyer等［7］的進(jìn)一步研究表明，α-syn引起的核聚集能夠?qū)е麓笫罂煽ㄒ蛳嚓P(guān)的行為發(fā)生變化。因此，α-syn的核轉(zhuǎn)位可能是共核蛋白病的致病機(jī)制。

我們前期的研究表明，α-syn可同時(shí)存在于胞核和胞質(zhì)中，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，α-syn能夠在核輸入蛋白importinα的介導(dǎo)下進(jìn)入細(xì)胞核，通過(guò)影響細(xì)胞周期而發(fā)揮毒性作用［8］。為了進(jìn)一步弄清α-syn在胞核內(nèi)的作用，本研究擬從核內(nèi)的核苷酸序列角度出發(fā)，應(yīng)用圓二色譜（circular dichroism，CD）分析的方法，在體外篩選可能被α-syn作用的核苷酸序列，為闡明α-syn核內(nèi)的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 核苷酸序列合成 核苷酸序列（Tab 1）由Invitrogen公司合成，并溶解于CD緩沖液（40 mmol·L-1citrate pH 5.6，100 mmol·L-1NaCl，1 mmol·L-1EDTA），終濃度為100μmol·L-1。

Tab 1 O ligonucleotide sequence

1.2 圓二色譜分析 首先測(cè)定蛋白質(zhì)和核苷酸序列的紫外（ultraviolet，UV）光譜，計(jì)算出儲(chǔ)存液濃度，然后測(cè)定緩沖液相對(duì)于比色皿的UV吸收譜。綜合分析得到數(shù)據(jù)，確定本實(shí)驗(yàn)中所用的蛋白和核苷酸序列的濃度。圓二色譜儀完成升溫后，取干凈比色皿加入緩沖液，放入儀器掃描基線值（波長(zhǎng)范圍230～410 nm），重復(fù)掃描兩次，取平均值以降低噪聲。基線掃描完成后，在相同條件下向比色皿中加入核苷酸序列溶液并進(jìn)行色譜掃描。完成后，在相同條件下將蛋白與核苷酸序列的混合液注入比色皿，并進(jìn)行色譜掃描。

Fig 2 CD spectra of nucleotide sequence composed of AC10，AG10，AT10，GC10，GT10 or TC10 after the adding ofα-syn-GFP protein

2 結(jié)果

2.1 α-syn-GFP蛋白對(duì)含堿基A的序列有較強(qiáng)作用 從Fig 1可以看出，對(duì)于含堿基A的序列而言，α-syn-GFP蛋白的加入能夠引起260～290 nm之間的色譜峰強(qiáng)度降低，而250 nm左右的色譜峰強(qiáng)度增加。因此，α-syn-GFP蛋白對(duì)含堿基A的序列有較強(qiáng)作用。而α-syn-GFP蛋白的加入僅使含堿基T的序列230～260 nm間的色譜峰稍有增加、含堿基C的序列290 nm左右的色譜峰稍有增加。因此，相對(duì)于含堿基A的序列來(lái)說(shuō)，α-syn-GFP蛋白對(duì)分別含堿基T和C的序列的作用較弱。

2.2 α-syn-GFP蛋白對(duì)分別含堿基AG、TC的序列有較強(qiáng)作用 從Fig 2可以看出，對(duì)于含堿基AT、AC、GC和TC的序列而言，α-syn-GFP蛋白的加入，并未對(duì)色譜峰產(chǎn)生明顯的影響，而α-syn-GFP蛋白的加入對(duì)分別含堿基AG、TC的序列的色譜峰有較大的影響。α-syn-GFP蛋白的加入導(dǎo)致含堿基AG的序列色譜峰在250～280 nm之間出現(xiàn)明顯的降低，并且整個(gè)峰發(fā)生了藍(lán)移。同樣，對(duì)于含堿基TC的序列而言，α-syn-GFP的加入導(dǎo)致整個(gè)色譜峰亦發(fā)生了藍(lán)移，且260～280 nm之間的峰強(qiáng)度有所降低。因此，α-syn-GFP蛋白與分別含堿基AG、TC的序列有較強(qiáng)作用。

2.3 α-syn-GFP蛋白對(duì)Kazak序列無(wú)明顯作用從Fig 3可以看出，無(wú)論是Kazak1序列、Kazak2序列，還是它們之間相互組合所形成的序列，α-syn-GFP蛋白的加入均未對(duì)色譜峰產(chǎn)生明顯影響，僅表現(xiàn)出小幅度的變化。

Fig 1 CD spectra of nucleotide sequence composed of A30，T30 or C30 after the adding ofα-syn-GFP protein

Fig 2 CD spectra of nucleotide sequence composed of AC10，AG10，AT10，GC10，GT10 or TC10 after the adding ofα-syn-GFP protein

2.4 α-syn-GFP蛋白對(duì)GC-box樣序列有較強(qiáng)作用從Fig 4可以看出，α-syn-GFP蛋白的加入對(duì)CAAT-box及增強(qiáng)子樣序列的作用亦較弱，而α-syn-GFP蛋白加入可導(dǎo)致GC-box樣序列色譜峰270 nm處峰強(qiáng)度明顯增加，推測(cè)可能是α-syn-GFP與GC-box樣序列發(fā)生特異作用，引起GC-box樣序列結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化的結(jié)果。

Fig 3 CD spectra of nucleotide sequence composed of Kazak1，Kazak2，Kazak1＋1，Kazak1＋2 or Kazak2＋2 after the adding ofα-syn-GFP protein

Fig 4 CD spectra of nucleotide sequence com posed of CAAT-box like，GC-box like or Enhancer after the adding ofα-syn-GFP protein

3 討論

α-syn廣泛分布于大腦神經(jīng)元的細(xì)胞核內(nèi)［1-2，5，9-10］。我們前期的研究表明，α-syn能夠在importinα的介導(dǎo)下進(jìn)入細(xì)胞核，并干擾細(xì)胞周期。因此，我們推測(cè)α-syn可能作用于細(xì)胞核內(nèi)的某些核苷酸序列，從而對(duì)細(xì)胞周期產(chǎn)生了影響。在此我們主要從體外角度出發(fā)，尋找可能被α-syn作用的核苷酸序列的特征，由于前期α-syn核輸入機(jī)制及功能的研究所用的α-syn蛋白均為與GFP融合的蛋白［8］，我們已有研究表明，GFP蛋白的引入幾乎不影響α-syn對(duì)核苷酸序列的作用。因此，為保證實(shí)驗(yàn)體系的一致性和研究的連續(xù)性，本研究選用經(jīng)酵母表達(dá)并進(jìn)行純化的α-syn-GFP蛋白進(jìn)行。

圓二色譜已被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析［11-12］。正常生理?xiàng)l件下，細(xì)胞內(nèi)存在的核酸通常呈現(xiàn)出多種不同的構(gòu)象［13］。近來(lái)的研究表明，核酸的結(jié)構(gòu)參數(shù)與它們的圓二色譜峰之間存在相互關(guān)聯(lián)的關(guān)系［14-15］，核酸和蛋白紫外吸收譜的重疊可用于研究核酸-蛋白質(zhì)間的相互作用。事實(shí)上，250～300 nm間的圓二色譜峰是由核酸的結(jié)構(gòu)來(lái)決定的，因?yàn)樵诖瞬ㄩL(zhǎng)范圍內(nèi)，相對(duì)于核酸而言，蛋白質(zhì)芳香發(fā)射基團(tuán)的作用是相對(duì)較弱的［16］。因此，本研究選擇波長(zhǎng)范圍在250～300 nm間的圓二色譜峰的強(qiáng)度進(jìn)行研究。

為了尋找可能被α-syn作用的核苷酸序列的特點(diǎn)，我們根據(jù)核酸組成及現(xiàn)有的相關(guān)順式作用元件的特點(diǎn)，合成了一系列的單鏈核苷酸序列，應(yīng)用圓二色譜分析α-syn蛋白對(duì)序列的影響，從中發(fā)現(xiàn)可能被α-syn作用的核苷酸序列的序列特點(diǎn)。

首先，我們分別合成了含30個(gè)堿基的序列，與α-syn-GFP蛋白混合后，用圓二色譜分析α-syn-GFP蛋白對(duì)序列的影響。由于核酸的結(jié)構(gòu)變化主要表現(xiàn)為波長(zhǎng)范圍250～290 nm內(nèi)色譜峰的變化，因此，我們把α-syn-GFP蛋白加入后250～290 nm范圍內(nèi)色譜峰的變化情況作為主要的觀察范圍。結(jié)果表明，對(duì)于含堿基A的核苷酸序列而言，色譜峰上270 nm左右的峰強(qiáng)度出現(xiàn)降低，而250 nm左右的峰強(qiáng)度則表現(xiàn)為增加。另外，α-syn-GFP對(duì)分別含堿基C或T的核苷酸序列的影響較弱，僅表現(xiàn)為290 nm或250 nm左右的峰強(qiáng)度稍有增加。因此，α-syn-GFP蛋白可能更傾向于影響含堿基A的核苷酸序列。

為了進(jìn)一步獲得可能被α-syn作用的核苷酸序列的特征，我們?cè)黾恿撕塑账嵝蛄薪M合的復(fù)雜性，以兩兩堿基組合的方式合成了分別含有10對(duì)堿基AT、AG、AC、GT、GC、TC的核苷酸序列。圓二色譜分析結(jié)果表明，對(duì)于含AG的核苷酸序列而言，αsyn-GFP加入后色譜峰在270 nm左右的峰強(qiáng)度明顯降低，而250 nm左右的峰強(qiáng)度則增加，并且整個(gè)峰出現(xiàn)了藍(lán)移。同樣，α-syn-GFP蛋白的加入也使含TC的核苷酸序列的色譜峰270 nm和250 nm左右的峰強(qiáng)度都有所降低，整個(gè)峰也出現(xiàn)了藍(lán)移。因此，α-syn-GFP蛋白對(duì)分別含堿基AG或TC的序列有較強(qiáng)作用。然而，對(duì)于其余組合的核苷酸序列而言，色譜峰并無(wú)明顯變化。

綜合分析上述研究所得出的可能被α-syn-GFP作用的核苷酸序列的特點(diǎn)，我們推測(cè)CAAT-box樣序列、Kozak序列、GC-box樣序列、增強(qiáng)子序列等序列可能是α-syn-GFP主要作用的核苷酸序列。因此，我們分別合成了這些序列，并應(yīng)用圓二色譜進(jìn)行分析。結(jié)果表明，無(wú)論是Kozak1、Kozak2，還是這兩種序列的組合，圓二色譜峰僅在波長(zhǎng)270 nm時(shí)峰強(qiáng)度稍微有所增加。因此，α-syn-GFP對(duì)Kozak序列的作用不明顯。對(duì)CAAT-box及增強(qiáng)子樣序列而言，αsyn-GFP蛋白的加入亦未對(duì)其色譜峰產(chǎn)生明顯影響，而α-syn-GFP蛋白的加入?yún)s導(dǎo)致GC-box樣序列的色譜峰發(fā)生強(qiáng)烈的變化，表現(xiàn)為波長(zhǎng)270 nm處峰強(qiáng)度明顯增加，推測(cè)可能是α-syn-GFP與CAAT-box樣序列發(fā)生了特異作用，從而導(dǎo)致GC-box樣序列結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化的結(jié)果。

綜上所述，α-syn轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核后可能通過(guò)作用于GC-box樣序列，參與細(xì)胞核內(nèi)的基因表達(dá)調(diào)控，從而發(fā)揮生理或病理作用。

參考文獻(xiàn)：

［1］ Maroteaux L，Campanelli JT，Scheller R H.Synuclein：a neuronspecific protein localized to the nucleus and presynaptic nerve terminal［J］.JNeurosci，1988，8（8）：2804-15.

［2］ McLean P J，Ribich S，Hyman B T.Subcellular localization of alpha-synuclein in primary neuronal cultures：effect ofmissensemutations［J］.JNeural Transm Suppl，2000，（58）：53-63.

［3］ Specht C G，Tigaret CM，RastG F，etal.Subcellular localisation of recombinant alpha-and gamma-synuclein［J］.Mol Cell Neurosci，2005，28（2）：326-34.

［4］ Takahashi M，Kanuka H，F(xiàn)ujiwara H，et al.Phosphorylation of alpha-synuclein characteristic of synucleinopathy lesions is recapitulated in alpha-synuclein transgenic Drosophila［J］.Neurosci Lett，2003，336（3）：155-8.

［5］ Goers J，Manning-Bog A B，McCormack A L，et al.Nuclear localization of alpha-synuclein and its interaction with histones［J］.Biochemistry，2003，42（28）：8465-71.

［6］ Zhou M，Xu S，Mi J，et al.Nuclear translocation of alpha-synuclein increases susceptibility of MES23.5 cells to oxidative stress［J］.Brain Res，2013，1500：19-27.

［7］ Boyer F，Dreyer J L.Alpha-synuclein in the nucleus accumbens induces changes in cocaine behaviour in rats［J］.Eur JNeurosci，2007，26（10）：2764-76.

［8］ Ma K L，Song LK，Yuan Y H，etal.The nuclear accumulation of alpha-synuclein ismediated by importin alpha and promotes neurotoxicity by accelerating the cell cycle［J］.Neuropharmacology，2014，82：132-42.

［9］ Gomez-Tortosa E，Newell K，Irizarry M C，et al.alpha-Synuclein immunoreactivity in dementia with Lewy bodies：morphological staging and comparison with ubiquitin immunostaining［J］.Acta Neuropathol，2000，99（4）：352-7.

［10］Zhang L，Zhang C，Zhu Y，et al.Semi-quantitative analysis of alpha-synuclein in subcellular pools of rat brain neurons：an immunogold electronmicroscopic study using a C-terminal specificmonoclonal antibody［J］.Brain Res，2008，1244：40-52.

［11］Compton LA and Johnson W C，Jr.Analysis of protein circular dichroism spectra for secondary structure using a simplematrixmultiplication［J］.Anal Biochem，1986，155（1）：155-67.

［12］Lees JG，Miles A J，Wien F，et al.A reference database for circular dichroism spectroscopy covering fold and secondary structure space［J］.Bioinformatics，2006，22（16）：1955-62.

［13］Rich A.DNA comes in many forms［J］.Gene，1993，135（1-2）：99-109.

［14］Basham B，Schroth G P，Ho PS.An A-DNA triplet code：thermodynamic rules for predicting A-and B-DNA［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1995，92（14）：6464-8.

［15］Scarlett G P，Elgar S J，Cary PD，et al.Intact RNA-binding domains are necessary for structure-specific DNA binding and transcription control by CBTF122 during Xenopus development［J］.J Biol Chem，2004，279（50）：52447-55.

［16］Cary PD，Kneale G G.Circular dichroism for the analysis of protein-DNA interactions［J］.Methods Mol Biol，2009，543：613-24.