DHA促NGF誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞分化與BMPs通路關(guān)系的研究

周 心，石寶燕，吳科鋒，高 翔，黃俊炎，黃 韌，李文德，

（1.廣東醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，2.廣東天然藥物研究與開發(fā)重點(diǎn)實驗室，廣東湛江 524023；3.廣東省實驗動物監(jiān)測所，廣東 廣州 510260）

Omega-3脂肪酸是一組多元不飽和脂肪酸的家族，主要成員包括二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）。其中DHA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異性濃集，是神經(jīng)元細(xì)胞膜的主要組成部分［1］，而近年的研究發(fā)現(xiàn)，DHA對神經(jīng)分化、神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)改變以及學(xué)習(xí)記憶等都有明顯的促進(jìn)作用［2-3］。此外，大量的動物實驗及臨床實驗也證明，DHA的早期膳食供給能提高嬰兒后認(rèn)知能力發(fā)展［4］和幼鼠記憶相關(guān)的學(xué)習(xí)能力［5］。相反的，在發(fā)育期間缺乏DHA，降低大腦中的DHA含量，可誘發(fā)實驗動物的認(rèn)知缺陷［6］。而在年齡相關(guān)性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，如阿爾采末?。ˋlzheimer’s disease，AD）中，患者表現(xiàn)出認(rèn)知功能障礙，其海馬中DHA濃度水平較正常人有明顯下降，而補(bǔ)充DHA可有效改善這一癥狀［7］，這說明發(fā)育腦中高豐度的DHA參與神經(jīng)發(fā)育調(diào)節(jié)，而且其含量與認(rèn)知功能有著密切的聯(lián)系。盡管DHA已被廣泛應(yīng)用于保健醫(yī)療等領(lǐng)域，但其作用的分子機(jī)制至今尚不明確。而在已發(fā)現(xiàn)的眾多調(diào)控機(jī)制中，骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）是研究較為深入的明星分子。它是轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor-β）超家族的成員，其受/配體信號通路在神經(jīng)元分化與神經(jīng)元形態(tài)發(fā)育中發(fā)揮著重要作用［8］。DHA與BMPs相似的功能提示我們，兩者可能是通過相同的信號通路起作用的。而PC12細(xì)胞是大鼠腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞克隆化的細(xì)胞株，可在神經(jīng)生長因子NGF誘導(dǎo)下增殖和分化，是目前廣泛用來研究神經(jīng)細(xì)胞功能、分化和凋亡的一種細(xì)胞培養(yǎng)模型。因此，本實驗擬通過PC12細(xì)胞觀察DHA對NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞分化的作用及其對BMP信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 DMEM（Gibco公司）；NGF、DHA和多聚賴氨酸（Sigma公司）；胎牛血清、馬血清（Hyclone公司）；兔抗多克隆抗體MAP-2一抗、兔抗βactin、HRP-labeled Goat Anti-Rabbit IgG（H＋L）、HRP-labeled Goat Anti-Mouse IgG（H＋L）（Signalway Antibody公司）；DAPI（ROCHE公司）；兔抗來源的多克隆抗體BMP7一抗（Abcam公司）；羊抗來源的多克隆抗體BMPR-Ⅱ一抗、兔抗來源的多克隆抗體p-Smad 1/5/8和鼠抗來源的多克隆抗體BMP4一抗（Santa Cruz公司）、Affinity Purified Antibody cy3 Labeled Goat anti-Rabbit IgG（Kpl公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物有限公司）；總蛋白提取試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 PC12細(xì)胞培養(yǎng) PC12細(xì)胞（購自上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫）置于DMEM培養(yǎng)液中，內(nèi)含10%馬血清、5%胎牛血清、青霉素1×105U·L-1、鏈霉素1×105U·L-1，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞長至80%時，按1∶3分瓶傳代，約3 d傳代1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞分組進(jìn)行實驗。

1.3 實驗分組 PC12細(xì)胞用含10%馬血清、5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基以1×108個·L-1接種于預(yù)先多聚賴氨酸處理的12孔板中，24 h后換用含1%胎牛血清和1%馬血清的DMEM培養(yǎng)基，實驗分別設(shè)置對照組（100μg·L-1NGF）、DHA組（100μg·L-1NGF＋10μmol·L-1DHA）。

1.4 MAP-2與DAPI免疫熒光染色 吸棄培養(yǎng)基，PBS洗2次；預(yù)冷的4%多聚甲醛室溫固定30 min；PBS洗2次，每次 3 min；0.1%Triton-100作用5 min；PBS洗2次，每次3 min；封閉用正常山羊血清工作液室溫封閉20 min；吸出封閉液，勿洗；加入1∶150稀釋的MAP-2，4℃過夜；PBS洗3次，每次3 min；加入二抗稀釋液稀釋的Affinity Purified Antibody cy3 Labeled Goat anti-Rabbit IgG二抗，室溫避光孵育50 min；PBS洗3次，每次3 min；加入用蒸餾水稀釋至終濃度為2 mg·L-1的DAPI，室溫避光孵育15 min；PBS洗3次，每次3 min；倒置熒光相差顯微鏡觀察并拍照。隨機(jī)選取50個細(xì)胞，顯微鏡測微尺測量其突起長度和突起數(shù)目。

1.5 氣相色譜法檢測PC12細(xì)胞DHA的含量 將PC12細(xì)胞按照5×108·L-1接種于預(yù)先多聚賴氨酸處理含10%馬血清、5%胎牛血清DMEM的培養(yǎng)皿，培養(yǎng)24 h后，換用含1%胎牛血清和1%馬血清的DMEM培養(yǎng)基，分別在3、6、9 d時取出細(xì)胞，吸掉培養(yǎng)基，用含1%BSA的PBS洗2次，冰上刮取細(xì)胞于離心管中，4 000 r·min-1離心5 min；倒掉上清，加入1.5 ml正己烷，吹打混勻，用吸管轉(zhuǎn)移至干凈的螺旋帽玻璃瓶中；加入1.5 ml 4℃儲存的三氟化硼于螺旋帽玻璃瓶中，往瓶中吹氮?dú)饧s25 s，蓋緊瓶蓋；于恒溫干浴型加熱器中，100℃恒溫加熱1 h；加熱結(jié)束，置于室溫冷卻后每瓶中加入1 ml雙蒸水，渦旋振蕩1 min，3 000 r·min-1離心 5 min；用吸管將瓶中上層液轉(zhuǎn)移至干凈的氣相色譜瓶；在通風(fēng)廚中，用氮?dú)獯蹈蓺庀嗌V瓶中的液體；每個氣相色譜瓶加入100μl正己烷，渦旋振蕩2 min；把氣相色譜瓶中的正己烷轉(zhuǎn)移至內(nèi)存管，再放回氣相色譜瓶，蓋緊蓋子，封口膠封口，-20℃避光保存，切勿倒置。

1.6 W estern blot檢測 將PC12細(xì)胞按照5×108·L-1接種于預(yù)先多聚賴氨酸處理含10%馬血清、5%胎牛血清DMEM的培養(yǎng)皿，培養(yǎng)24 h后，換用含1%胎牛血清和1%馬血清的DMEM培養(yǎng)基，分別在3、6、9 d時取出細(xì)胞，吸掉培養(yǎng)基，用含1%BSA的PBS洗兩次，將培養(yǎng)皿中的PC12細(xì)胞用細(xì)胞刮冰上收集到相應(yīng)離心管中，2 000 r·min-1離心10 min，PBS漂洗1次，使用總蛋白提取試劑盒提取蛋白，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒定量蛋白濃度。每孔上樣50μg蛋白，12%SDS-PAGE凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。一抗 BMP4（1∶50）、BMP7（2.5 mg·L-1）、BMPR-Ⅱ（1∶50）、p-Smad 1/5/8（1∶50）、β-actin（1∶500），二抗（1∶1 000），化學(xué)發(fā)光法顯示結(jié)果，壓片曝光，顯影定影后掃描。利用Image-Pro plus 6.0分析軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行分析，以目的條帶與內(nèi)參β-actin的平均吸光度比值表示相對表達(dá)水平，進(jìn)行半定量分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 每個實驗至少重復(fù)3次，每次實驗至少有3個重復(fù)值。實驗結(jié)果數(shù)據(jù)均采用ˉx±s表示，并采用GraphPad統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差（One-Way ANOVA）分析。

Tab 1 Effect of DHA on neurite development of PC12 cells（±s）

Tab 1 Effect of DHA on neurite development of PC12 cells（±s）

**P＜0.01 vs control group.

Group Neurite-length/μm Number of neurite 3 d 6 d 9 d Control 7.4±0.8 17.8±5.3 22.4±3.8 0.6±0.5 1.3 d 6 d 9 d 4±1.0 1.8±0.7 DHA 18.6±3.9** 34.3±10.9** 39.7±7.9** 1.8±0.7** 2.8±0.9** 3.3±1.1**

2 結(jié)果

2.1 MAP-2免疫熒光法觀察DHA對NGF誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞突起的影響 如Fig 1和Tab 1所示，對照組細(xì)胞在培養(yǎng)3 d時，只有少數(shù)細(xì)胞長出細(xì)短的突起；而DHA與NGF共同作用3 d時，細(xì)胞突起長度與對照組相比增長。DHA與NGF共同作用6 d時，DHA組與對照組的細(xì)胞相比，DHA組細(xì)胞的突起增長、突起數(shù)目增多；同樣的，DHA與NGF共同作用9 d，與對照組相比，DHA組細(xì)胞的體積增大，突起長度明顯增長，突起數(shù)目明顯增多。

2.2 氣相色譜檢測PC12細(xì)胞中的DHA含量 氣相色譜檢測結(jié)果如Tab 2所示，在培養(yǎng)3 d時，對照組細(xì)胞的DHA含量過低，不在檢測限之內(nèi)，而DHA組細(xì)胞的DHA含量為2.48%；培養(yǎng)6 d時，對照組細(xì)胞的DHA含量仍低，不在檢測限之內(nèi)，而DHA組細(xì)胞的DHA含量為5.68%；培養(yǎng)9 d時，對照組細(xì)胞DHA含量為1.3%，DHA組為6.98%。

Fig 1 Promotion effect of DHA on NGF-induced neurite outgrow th in PC12 cells（200×）

Tab 2 DHA content of DHA group and control group analysed by gas chromatography（ˉ±s）

Tab 2 DHA content of DHA group and control group analysed by gas chromatography（ˉ±s）

“--”Notwithin the limits of detection.**P＜0.01 vs control group.

G r o u p D H A c o n t e n t/%3 d 6 d 9 d C o n t r o l -- -- 1.3 0±0.2 5 D H A 2.4 8±0.2 8**5.6 8±0.7 2**6.9 8±0.5 4**

2.3 W estern blot結(jié)果 用Western blot的方法檢測 PC12細(xì)胞BMP4、BMP7、BMPR-Ⅱ和 p-Smad 1/5/8蛋白的表達(dá)。結(jié)果如Fig 2所示，與對照組相比，DHA組細(xì)胞的BMP7、BMPR-Ⅱ蛋白表達(dá)明顯增加，以作用6 d的細(xì)胞表達(dá)量較多；DHA組細(xì)胞BMP4和p-Smad 1/5/8表達(dá)量高于對照組，且6 d和9 d的細(xì)胞表達(dá)量較多。

3 討論

DHA促進(jìn)大腦發(fā)育及改善認(rèn)知功能的觀點(diǎn)在學(xué)界已得到普遍認(rèn)同。近年的研究發(fā)現(xiàn)，DHA主要影響腦內(nèi)神經(jīng)元的生長狀況，且補(bǔ)充DHA可促進(jìn)成年哺乳動物DG區(qū)神經(jīng)元的分化，增加神經(jīng)元樹突棘的密度和活性神經(jīng)元的數(shù)目，增強(qiáng)神經(jīng)元突觸可塑性［9-10］。此外，DHA還可促進(jìn)胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)元及擬神經(jīng)細(xì)胞如PC12細(xì)胞等的增殖和分化能力，并能明顯增加各類細(xì)胞突起的長度和分支數(shù)目［11-13］。從本實驗MAP-2免疫細(xì)胞化學(xué)染色的結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)9 d的PC12細(xì)胞對照組與DHA組相比差異明顯，DHA組細(xì)胞體積、突起長度和數(shù)目都明顯比對照組增大和增多，證明了在NGF存在的情況下，DHA可以明顯促進(jìn)PC12細(xì)胞突起的生長及提高PC12細(xì)胞的分化水平。我們進(jìn)一步用氣相色譜法探討PC12細(xì)胞在給予DHA處理后，細(xì)胞DHA含量的變化，氣相色譜的結(jié)果表明，對照組PC12細(xì)胞隨著NGF誘導(dǎo)時間的增加，細(xì)胞的突起長度不斷增長、突起數(shù)目不斷增多，且細(xì)胞中DHA的含量也不斷增多，但與DHA組相比，DHA組細(xì)胞的DHA含量更高。以上結(jié)果進(jìn)一步表明了補(bǔ)充DHA有助于增強(qiáng)NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的分化。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中，神經(jīng)元分化和隨后的形態(tài)發(fā)生是其中最為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。骨形態(tài)發(fā)生蛋白是轉(zhuǎn)化生長因子超家族的成員，最早被發(fā)現(xiàn)是與骨骼系統(tǒng)的發(fā)育形成過程密切相關(guān)，而越來越多的研究表明，不同亞型的骨形態(tài)發(fā)生蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)的不同區(qū)域呈持續(xù)性表達(dá)，一系列的實驗研究表明，不同亞型的BMPs配體蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，如BMP2、BMP4和BMP7在頂蓋區(qū)域有特異的高表達(dá)，若采用基因手段干預(yù)其表達(dá)，則會引起許多中樞神經(jīng)結(jié)構(gòu)的表達(dá)缺失，造成先天畸形［14］。Lein等［15］早在上世紀(jì) 90年代就發(fā)現(xiàn) BMP7對交感神經(jīng)元樹突發(fā)育有強(qiáng)大的促進(jìn)作用。也有研究［16］指出BMP7表達(dá)的缺失可導(dǎo)致腦膜和海馬發(fā)育缺陷。進(jìn)一步的研究也發(fā)現(xiàn)［17］，另一配體蛋白BMP2具有類似神經(jīng)營養(yǎng)因子的作用，可誘導(dǎo)PC12細(xì)胞系神經(jīng)分化，促進(jìn)神經(jīng)元形態(tài)發(fā)生，并在體外培養(yǎng)環(huán)境中發(fā)揮促進(jìn)GABA能神經(jīng)元存活和分化的作用［18］。但目前尚無明確的研究證實，DHA促進(jìn)神經(jīng)元或擬神經(jīng)細(xì)胞的分化及生長與BMPs配體蛋白的表達(dá)有關(guān)。

本實驗發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，添加10μmol·L-1DHA可不同程度的上調(diào)了BMP4、BMP7、BMPRⅡ和P-smad 1/5/8蛋白的表達(dá)，這說明補(bǔ)充DHA可能促進(jìn)BMPs配體蛋白的表達(dá)，促進(jìn)BMPs信號通路的活化。以上結(jié)果表明，增加PC12細(xì)胞的DHA攝取，能促進(jìn)NGF誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞分化過程，其機(jī)制可能與上調(diào)BMPs中 BMP4、BMP7蛋白的表達(dá)，激活更多的BMPRII受體并與之結(jié)合，使I型受體磷酸化后，招募效應(yīng)分子Smad 1/5/8，使Smad 1/5/8磷酸化水平升高。大量的磷酸化 Smad 1/5/8與Smad4結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)至核內(nèi)，在其他轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同作用下，形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物結(jié)合至靶基因的調(diào)控區(qū)域，從而調(diào)控靶基因的表達(dá)以發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。

Fig 2 Expression of BMP4，BMP7，BMPR-Ⅱand p-Smad 1/5/8 protein upregulated by DHAˉx±s，n＝3）*P＜0.05，**P＜0.01 vs control

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