硫化氫對(duì)大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制

李新娟，魏林郁，李超堃，盧 娜，王國紅，趙紅崗，李東亮

（河南省新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與神經(jīng)生物學(xué)教研室，河南新鄉(xiāng) 453003）

缺血性腦血管疾病以其高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率而嚴(yán)重危害人類健康，目前對(duì)其尚無完全有效的治療手段。近年來的研究表明，硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）是繼NO和CO之后發(fā)現(xiàn)的第3種具有生物活性的內(nèi)源性氣體信號(hào)分子，H2S不借助任何特殊的運(yùn)輸工具就能快速通過細(xì)胞膜，對(duì)一系列生物靶點(diǎn)產(chǎn)生影響。越來越多的證據(jù)表明，H2S對(duì)多種組織的在體或離體缺血/再灌注損傷模型具有細(xì)胞保護(hù)作用［1-3］。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，H2S供體化合物硫氫化鈉（sodium hydrosulfide，NaHS）對(duì)腦缺血/再灌注引起的神經(jīng)元損傷有保護(hù)作用［4］，但其保護(hù)機(jī)制尚不完全清楚。另有研究表明，P2X7受體在腦缺血損傷的病理生理過程中扮演著重要的角色［5］，而目前關(guān)于H2S對(duì)缺血/再灌注腦組織中P2X7受體表達(dá)的影響國內(nèi)外尚未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)通過制備大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，觀察H2S對(duì)局灶性腦缺血/再灌注損傷大鼠腦組織中P2X7受體蛋白表達(dá)的影響，探討H2S對(duì)缺血/再灌注損傷腦保護(hù)作用的可能機(jī)制，為更好地預(yù)防與治療缺血性腦血管疾病提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 NaHS購自Sigma公司。2，3，5-三苯基氯化四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）購自北京生化制藥廠。兔抗鼠P2X7多克隆抗體（sc-25698）購自 Santa Cruz。Cy3標(biāo)記羊抗兔IgG、DAPI、抗熒光淬滅封片液均購自碧云天生物技術(shù)研究所。MCAO栓線購自北京沙東生物技術(shù)有限公司。

1.2 動(dòng)物分組與給藥方法 Sprague-Dawley（SD）大鼠♂，合格證號(hào)：SCXK（豫）2010-0002，體質(zhì)量200～240 g，隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組、腦缺血/再灌注（I/R）組、NaHS＋I(xiàn)/R組，如有動(dòng)物死亡，隨機(jī)選取大鼠補(bǔ)足每組16只。NaHS＋I(xiàn)/R組于插入栓線后10 min按25μmol·kg-1的劑量腹腔注射現(xiàn)配置的NaHS生理鹽水溶液，假手術(shù)組和I/R組在相同時(shí)間點(diǎn)腹腔注射等容積生理鹽水。

1.3 動(dòng)物模型的制備［6-7］參照Longa等方法，略做改進(jìn)制備大鼠左側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞模型。100 g·L-1水合氯醛（350 mg·kg-1，ip）麻醉動(dòng)物，頸部備皮，正中剪開皮膚，鈍性分離腺體和筋膜，依次分離左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈。在頸內(nèi)和頸外動(dòng)脈分叉處結(jié)扎頸外動(dòng)脈，同時(shí)結(jié)扎頸總動(dòng)脈，動(dòng)脈夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，在頸總動(dòng)脈結(jié)扎線上方穿線打松結(jié)備用，頸總動(dòng)脈結(jié)扎線上方斜剪一小口，將AA級(jí)2432的栓線由此插入動(dòng)脈，將栓線慢慢插入頸內(nèi)動(dòng)脈，去除動(dòng)脈夾，當(dāng)栓線進(jìn)入距頸內(nèi)和頸外動(dòng)脈分叉處約18～19 mm有阻擋感時(shí)停止插入栓線，用頸總動(dòng)脈上穿的備用線固定栓線，縫合皮膚。將動(dòng)物放回籠中，置于室溫26℃的室內(nèi)。缺血2 h，乙醚吸入麻醉動(dòng)物后，將栓線輕輕拔至有阻力時(shí)提示栓線頭端已至頸總動(dòng)脈切口處。假手術(shù)組僅分離動(dòng)脈。

1.4 大鼠死亡率計(jì)算、神經(jīng)功能缺陷評(píng)分［7］統(tǒng)計(jì)各組大鼠的死亡情況，死亡率以各組死亡大鼠數(shù)量/各組樣本量×100%計(jì)算；大鼠腦缺血2 h，再灌注24 h，參照Longa 5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能行為評(píng)分，0分：無神經(jīng)功能缺失癥狀；1分：輕度局灶性神經(jīng)功能缺失（不能完全伸展對(duì)側(cè)前肢）；2分：中度局灶性神經(jīng)功能缺失（向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈）；3分：重度局灶性神經(jīng)功能缺失（向?qū)?cè)傾倒）；4分：不能自發(fā)行走，意識(shí)水平降低。

1.5 大鼠腦組織切片TTC染色測定腦梗死體積［8］大鼠腦缺血 2 h，再灌注 24 h，迅速斷頭取腦，將鼠腦-20℃凍10 min后在冰盤上進(jìn)行冠狀切片，在視交叉切第1刀，在視交叉前3 mm切第2刀，在視交叉后3 mm切第3刀，在第3刀后3 mm切第4刀，將5片腦組織放入質(zhì)量濃度為20 g·L-1的TTC磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）中，37℃避光恒溫孵育30 min，40 g·L-1多聚甲醛磷酸鹽緩沖液固定24 h后拍照。使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件計(jì)算腦梗死體積。梗死體積百分率/%＝（正常側(cè)大腦半球體積-梗死側(cè)非梗死區(qū)腦組織體積）/正常側(cè)大腦半球體積×100%。

1.6 免疫熒光檢測P2X7受體蛋白表達(dá) 大鼠腦缺血2 h，再灌注24 h，常規(guī)麻醉動(dòng)物，開胸暴露心臟，經(jīng)左心室插灌注管至升主動(dòng)脈并固定，同時(shí)右心耳剪一小洞放血，先快速灌注生理鹽水200 m l沖去全身血液，然后灌注4℃40 g·L-1多聚甲醛磷酸鹽緩沖液固定（pH 7.4），待大鼠全身僵硬后，斷頭取腦，將腦組織置于40 g·L-1多聚甲醛磷酸鹽緩沖液（pH 7.4），4℃后固定過夜，150、300 g·L-1蔗糖溶液脫水后，厚20μm冰凍切片，附于防脫載玻片上。1 ml·L-1Triton X-100磷酸鹽溶液洗5 min，微波修復(fù)15 min，山羊血清封閉20 min，兔抗鼠P2X7多克隆抗體（1∶150）4℃過夜，陰性對(duì)照用PBS代替一抗，Cy3標(biāo)記羊抗兔 IgG（1∶500）室溫2 h，DAPI復(fù)染核3 min，抗熒光淬滅封片液封片。熒光顯微鏡觀察并拍照，每只動(dòng)物取3張腦片，隨機(jī)觀察損傷側(cè)大腦皮質(zhì)和海馬CA1區(qū)，分別在400倍鏡下數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)目，求各平均值，分別代表該動(dòng)物損傷側(cè)大腦皮質(zhì)和海馬CA1區(qū)P2X7受體蛋白陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料用ˉx±s表示，多組之間顯著性檢驗(yàn)用單因素方差分析；兩兩均數(shù)比較采用LSD檢驗(yàn)，分類資料采用非參數(shù)檢驗(yàn)中的Mann-Whitney U法。

2 結(jié)果

2.1 NaHS對(duì)腦缺血/再灌注損傷大鼠死亡率、神經(jīng)功能缺陷評(píng)分的影響 NaHS＋I(xiàn)/R組共用22只大鼠，死亡6只；I/R組共用28只大鼠，死亡12只；NaHS＋I(xiàn)/R組大鼠死亡率（27.27%）明顯低于I/R組（42.86%）。I/R組大鼠神經(jīng)功能缺陷評(píng)分明顯高于假手術(shù)組（P＜0.01），NaHS＋I(xiàn)/R組大鼠神經(jīng)功能缺陷評(píng)分明顯低于I/R組（P＜0.05），見Tab 1。

Tab 1 The neurological impairment scores of rat in different groups

2.2 NaHS對(duì)腦缺血/再灌注損傷大鼠腦梗死體積的影響 TTC染色腦片顯示，假手術(shù)組兩側(cè)大腦半球呈均勻紅染，I/R組和NaHS＋I(xiàn)/R組正常腦組織染色為紅色，左側(cè)腦梗死組織呈蒼白色，且NaHS＋I(xiàn)/R組腦梗死體積百分率（21.88%±3.53%）明顯小于I/R組（36.71% ±3.73%）（P＜0.01），見Fig 1。

2.3 NaHS對(duì)腦缺血/再灌注損傷大鼠大腦皮質(zhì)、海馬CA1區(qū)P2X7受體蛋白表達(dá)的影響 熒光顯微鏡下觀察，各組大鼠大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)均可見P2X7受體免疫陽性細(xì)胞，陽性細(xì)胞胞膜和胞質(zhì)呈紅色。與假手術(shù)組相比，I/R組損傷側(cè)大腦皮質(zhì)、海馬CA1區(qū)P2X7陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)明顯增多（P＜0.01）；與I/R組相比，NaHS＋I(xiàn)/R組損傷側(cè)大腦皮質(zhì)、海馬CA1區(qū)P2X7陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.01），見 Fig 2、3

3 討論

腦缺血是導(dǎo)致老年人死亡和殘疾的最常見的一種疾病，且隨著人口老齡化，其發(fā)病率還有增加的趨勢。目前治療腦缺血最有效的方法是盡快恢復(fù)大腦的血液供應(yīng)，臨床上常采用藥物或者介入手段改善腦血液循環(huán)，但在腦血流灌注恢復(fù)的過程中，由于鈣超載、氧自由基過飽和等產(chǎn)生的興奮性毒性作用會(huì)進(jìn)一步加重腦組織的損傷，稱為腦缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷。所以腦缺血治療的研究不應(yīng)只局限于如何恢復(fù)腦組織血液供給，也應(yīng)該針對(duì)I/R損傷的機(jī)制采取措施。

Fig 1 Effects of NaHS on the volume percentage of cerebral infarction after cerebral ischem ia/reperfusion injury in rat（ˉx±s，n＝6）A：Brain sliceswith TTC staining；B：The volume percentage of cerebral infarction of rat in different groups.**P＜0.01 vs sham-operated group；＃＃P＜0.01 vs I/R group.

Fig 2 Effects of NaHS on expression of P2X7 receptor protein in cerebral cortex after cerebral ischem ia/reperfusion injury in rats（ˉx±s，n＝10）Cy3/DAPIdouble stained（×400，Scale bar＝30μm）a：Shamoperated group；b：I/R group；c：NaHS（25μmol·kg-1） ＋ I/R.**P＜0.01 vs sham-operated group；＃＃P＜0.01 vs I/R group.

Fig 3 Effects of NaHS on expression of P2X7 receptor protein in the hippocampal CA1 area after cerebral ischem ia/reperfusion injury in rats（±s，n＝10）Cy3/DAPIdouble stained（×400，Scale bar＝30μm）a：Shamoperated group；b：I/R group；c：NaHS（25μmol·kg-1）＋I(xiàn)/R.**P＜0.01 vs sham-operated group；＃＃P＜0.01 vs I/R group.

P2X7受體是嘌呤能受體P2X家族中非常獨(dú)特的一個(gè)亞型，是三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）門控的陽離子通道，廣泛分布于神經(jīng)細(xì)胞。在正常情況下，胞外微摩爾水平的ATP可激活P2X7受體，選擇性地引起Ca2＋、Na＋內(nèi)流，細(xì)胞去極化，神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生正常的興奮活動(dòng)；然而腦缺血損傷時(shí)，損傷周圍細(xì)胞外出現(xiàn)高濃度（數(shù)個(gè)毫摩爾水平）ATP聚集［5］，P2X7受體在高濃度的細(xì)胞外ATP反復(fù)持久刺激下，可由陽離子通道轉(zhuǎn)變?yōu)榉沁x擇性膜孔，其通透性明顯增強(qiáng)，分子質(zhì)量較大的有機(jī)陽離子均可通過，進(jìn)而激發(fā)NO、鈣超載、活性氧及炎性體的生成，導(dǎo)致細(xì)胞二次損傷甚至死亡［9］，因此，認(rèn)為P2X7受體可能在腦缺血后繼發(fā)性損傷中起關(guān)鍵作用。本研究通過建立短暫性大腦中動(dòng)脈栓塞模型，發(fā)現(xiàn)腦缺血2 h，再灌注24 h損傷側(cè)腦皮質(zhì)和海馬CA1區(qū)P2X7受體蛋白表達(dá)明顯高于假手術(shù)組，與王麗雁等［10］建立新生大鼠缺氧缺血性腦損傷的研究結(jié)果相一致，同時(shí)本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)腦缺血2 h，再灌注24 h時(shí)可出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺陷和損傷側(cè)腦組織的梗死灶，與王春燕等［11］研究結(jié)果一致，這些提示腦I/R損傷后P2X7受體蛋白的高表達(dá)，可能造成細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的改變，導(dǎo)致細(xì)胞二次損傷甚至死亡，這或許是引發(fā)腦I/R后神經(jīng)功能缺陷和腦組織損傷的原因之一。另有研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用P2X7受體拮抗劑亮藍(lán)G可明顯降低氧糖剝奪引起的神經(jīng)元死亡和MCAO后腦梗死體積［12］。因此，如何抑制P2X7受體的表達(dá)成為腦I/R損傷治療的研究熱點(diǎn)。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，哺乳類動(dòng)物的許多細(xì)胞和組織都能產(chǎn)生H2S，它主要在胱硫醚-β-合成酶（cystathionineβ-synthase，CBS）、3-巰基丙酮酸轉(zhuǎn)硫酶（3-mercaptopyruvate sulfurtransferase，3MST）和胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionineγ-lyase，CSE）的作用下生成，CBS和CES主要以半胱氨酸為底物，通過轉(zhuǎn)硫作用生成H2S，3MST可與半胱胺酸轉(zhuǎn)氨酶共同作用，以L-半胱氨酸和α-酮戊二酸為底物生成H2S，其中CBS和3MST在神經(jīng)系統(tǒng)中有表達(dá)，可使神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生內(nèi)源性H2S［13］。H2S在體內(nèi)發(fā)揮著廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，已有的研究表明，給予外源性H2S可對(duì)抗多種組織細(xì)胞的損傷而發(fā)揮保護(hù)作用［1-3］，本實(shí)驗(yàn)室前期的研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腦I/R 12 h大鼠海馬、前腦皮質(zhì)組織中H2S含量、CBS活性、CBSmRNA及CBS蛋白表達(dá)均明顯高于假手術(shù)組，而腦I/R 24 h則均明顯低于假手術(shù)組，腦I/R 48 h硫化氫含量恢復(fù)到正常水平；且H2S供體化合物NaHS（25 μmol·kg-1）對(duì)腦I/R引起的神經(jīng)元損傷有保護(hù)作用［4］。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察了外源性H2S對(duì)腦缺血2 h，再灌注24 h時(shí)死亡率、神經(jīng)功能缺陷評(píng)分、腦梗死體積及腦組織中P2X7受體蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NaHS＋I(xiàn)/R組大鼠死亡率、神經(jīng)功能缺陷評(píng)分及腦梗死體積明顯低于I/R組，提示在腦I/R 24 h H2S/CBS體系下調(diào)的情況下，給予外源性H2S能明顯減輕腦I/R損傷的程度；并且本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)大鼠腦缺血2 h，再灌注24 h時(shí)，NaHS＋I(xiàn)/R組損傷側(cè)腦皮質(zhì)和海馬CA1區(qū)P2X7受體蛋白表達(dá)明顯低于I/R組，這些提示H2S可能通過下調(diào)腦I/R損傷大鼠腦皮質(zhì)和海馬CA1區(qū)P2X7受體蛋白的表達(dá)，減輕腦I/R損傷，從而改善腦I/R損傷后大鼠的死亡率、神經(jīng)功能缺陷評(píng)分和腦梗死體積，這可能是H2S發(fā)揮腦保護(hù)作用的機(jī)制之一，而這種保護(hù)機(jī)制是否通過調(diào)節(jié)腦I/R損傷后P2X7-Ca2＋信號(hào)途徑而起作用？這值得進(jìn)一步研究。

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