H9亞型禽流感病毒欽州株HA基因的克隆與遺傳進化

陳進喜，張華智，黃 梅，鄭彥梓，翟成兵，熊 毅，鄭 敏，施開創(chuàng)

（1.欽州市動物疫病預防控制中心，廣西 欽州 535099；2.欽州市畜牧站，廣西 欽州 535099；3.廣西動物疫病預防控制中心，廣西 南寧 530001）

禽流感（avian inf l uenza，AI）是由正黏病毒科的A型流感病毒（inf l uenza A viruses）引起的一種禽類的感染和/或疾病綜合癥，對家禽造成嚴重的危害。自1966年首次分離到H9N2亞型禽流感病毒以來，該型病毒目前已經普遍存在于世界各國的禽群中，流行毒株可分為北美及歐亞兩種系[1]。1994年陳伯倫等[2]報道了中國大陸的首例禽流感病毒感染并從廣東雞群中分離到了H9N2亞型禽流感毒株。2003年分離到的人H9N2禽流感病毒（A/Hong Kong/2108/03）是一個新的重組體，很可能來源于當地的活禽市場[3]。AIV存在著廣泛的抗原漂移和抗原轉變現象，其抗原變異頻率很高，而在AIV所編碼的各種蛋白質中，又以HA基因的突變頻率最高；HA還是AIV中最主要的保護性抗原。本研究采集活禽交易市場臨床健康雞的氣管和泄殖腔的棉拭子，對其進行H9亞型禽流感檢測，并擴增HA基因序列，力圖闡述欽州地區(qū)H9N2禽流感HA基因的分子遺傳規(guī)律。為研究禽流感病毒的分布以及控制禽流感的流行、蔓延提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 病毒

研究樣品采自欽州市活禽交易市場臨床健康雞的氣管和泄殖腔棉拭子，由廣西區(qū)動物疫病預防控制中心實驗室保存； 陽性對照：禽流感（H5+H9）二價滅活疫苗，青島易邦生物工程有限公司產品。

1.2 SPF雞胚

9-11日齡無特定病原（SPF）雞胚由山東省農科院家禽研究所禽病研究中心提供。

1.3 引物

參考GenBank上已發(fā)表并上傳的H9N2亞型基因序列，選擇保守區(qū)域應用Oligo6.0軟件設計并合成特異性引物：H9亞型分型用的引物：H9F：5’-CTYCACACAGARCACAATGG-3’；H9R：5’-GCCACACTTGHGGTRTC-3’；擴增HA基因片段全長用引物：HA1：5’-GGGGAAT TTCACAACCACTCAAG-3’；HA2：5’-TTGAGT AGAAACAAGGGTGTTTC-3’；反轉錄用引物Uni12：5’-AGCRAAAGCA-GG-3’。

1.4 病毒RNA的提取及RT-PCR

按試劑盒操作說明提取病毒總RNA。以總RNA為模板，采用反轉錄引物Uni12進行反轉錄，獲得cDNA。以cDNA為模板，應用設計的特異性引物，進行PCR擴增。反應體系總體積25 μL： 內含模板2.0 μL，加10×Reaction Buffer 2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/μL）2.0 μL，Taq DNA酶（5 U/μL）0.25 μL，MgCl2（25 mmol/L）1 μL，上下游引物（25 pmol/μL）各0.5 μL，加ddH2O至25 μL，置PCR儀中。反應程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，（H9亞型分型用57 ℃、擴增HA基因片段全長用54 ℃）45 s，72 ℃ 1 min，35 個循環(huán)；72 ℃ 10 min。反應結束后，取PCR產物7 μL在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，置凝膠成像系統中觀察結果。

1.5 PCR產物的克隆及序列分析

回收PCR產物中目的片段，回收目的DNA按連接試劑盒說明書進行連接，然后將連接產物轉化到感受態(tài)細胞DH5α中，涂平板，培養(yǎng)16 h，挑斑接種于LB液體培養(yǎng)基中，置37 ℃搖床培養(yǎng)16 h；取1.0 mL培養(yǎng)物抽提重組質粒，進行酶切及PCR鑒定，將陽性菌株送寶生物工程（大連）公司進行測序。將測序結果與已發(fā)表的基因序列進行分析。

2 結果

2.1 H9亞型禽流感病毒PCR檢測結果

用H9亞型禽流感病毒分型引物對臨床健康的雞棉拭子進行檢測，出現488 bp大小的片段確定為H9亞型禽流感病毒陽性（圖1）。所采集的樣品中有1份為H9亞型禽流感病毒陽性（命名為：A/Chicken/Guangxi/qz40/2009，簡稱qz40）。

圖1 H9亞型禽流感病毒PCR檢測結果圖

2.2 病毒的增殖和純化

將H9亞型禽流感病毒PCR檢測陽性的棉拭子經雙抗處理后8000 r/min離心10 min，取上清液接種9 ～ 11日齡SPF雞胚絨毛尿囊膜（0.2 mL/胚），37 ℃孵育，間隔6 ～ 12 h照胚一次，死胚置4 ℃過夜，無菌收集24 ～ 96 h死亡的雞胚尿囊液，用1%的雞紅細胞測定其血凝效價。然后根據血凝效價進行10-1000倍有限稀釋后繼續(xù)接種SPF雞胚，至少傳3代，收獲血凝滴度≥7log2的尿囊液于 -70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 HA基因的PCR擴增

應用HA1/HA2引物擴增出qz40株的HA基因全長，PCR產物經10 g/L瓊脂糖凝膠上電泳分析表明，與預期結果相符（圖2）?；厥誔CR產物中目的片段，連接、轉化、挑斑，將酶切及PCR鑒定陽性的菌株進行測序。

圖2 HA基因的PCR產物電泳圖

2.4 序列測定及同源性分析

將所獲qz40株的HA基因核苷酸序列的測序結果拼接后（圖3），HA基因的cDNA包括一個完整的開放閱讀框，編碼區(qū)由1683 bp組成，共編碼560個氨基酸，包括信號肽（1aa – 18aa）、HA1（19aa – 337aa）、HA2（339aa – 560aa） 和一個精氨酸（338aa）。經DNAStar軟件將所獲毒株的HA基因序列與從GenBank中獲得的26個H9N2亞型禽流感病毒HA基因核苷酸序列及其推導的氨基酸序列進行同源性比較，由表1可知，qz40株與A/chicken/Guangxi/21/2006株的核苷酸同源性最高，達99.9%，與A/Duck/HongKong/Y439/97株的核苷酸同源性最低，僅為82.8%；推導的氨基酸同源性介于87.5% ～ 99.6%之間。

2.5 功能位點分析

推導的氨基酸序列分析表明，qz40株含有7個潛在的N-糖基化位點（Asn-X-Ser/Thr，X為除Pro以外的任意氨基酸），其中5個位于HA1部分，為NST（29aa-31aa）、NVS（141aa-143aa）、NRT（218aa-220aa）、NTT（298aa-300aa）、NVS（305aa-307aa）；2個 位 于 HA2部 分， 為NGT（492aa-494aa）、NGS（55laa-553aa）。 裂解位點序列（335aa-341aa）分析發(fā)現，該毒株為RSSR↓GLF，為非高致病力毒株的典型特征，對禽類為低致病力。構成受體結合位點的氨基酸位于 109aa、161aa、163aa、191aa、198aa、202aa、203aa（qz40株的受體結合位點的氨基酸依次YWTNTLY），通過與其他參考毒株相比，198位氨基酸變化較大，其中本研究的qz40株為T，而A/Chicken/Beijing/1/94為 V，A/Quail/HongKong/G1/97和A/Duck/HongKong/Y439/97都為E，其它位點的氨基酸相對保守。

圖3 qz40株HA基因測序結果

表1 qz40株HA基因的核苷酸序列及其推導的氨基酸序列與其他H9N2毒株的比對（%）

2.6 進化樹分析

基于H9亞型禽流感病毒HA基因核苷酸序列繪制的系統發(fā)育進化樹（圖4）。從進化樹可以分為3個群系，分別為：A/Chicken/Beijing/1/94（Ck/Bei-like）、A/Quail/HongKong/G1/97（G1-like）和A/Duck/HongKong/Y439/97（Y439-like）。從本研究建立的基于H9亞型HA基因進化樹發(fā)現，欽州分離的qz40株屬于A/Chicken/Beijing/1/94（Ck/Bei-like）群系，與國內參考株的親緣關系較近。而與A/Duck/HongKong/Y439/97（Y439-like）群系的親緣關系較遠。

圖2 HA基因的PCR產物電泳圖

3 討論

禽流感病毒粒子表面有二種主要的纖突，分別為血凝素（HA）和神經氨酸酶（NA）。HA在病毒吸附及穿膜過程中起關鍵作用，能刺激機體產生中和抗體從而中和病毒的感染[4]。目前，在世界范圍內的各種家禽和野禽中，按照HA的表面抗原來區(qū)分，有15種特異的HA（H1-H15）[5]。

本研究運用H9亞型分型引物對采集的棉拭子進行PCR篩選，選取PCR檢測陽性的樣品，接種SPF雞胚進行病毒的增殖，通過有限稀釋克隆法純化3代后，獲得相對穩(wěn)定、血凝滴度較高（≥71og2）的種毒，分裝后保存于 -70℃?zhèn)溆?。本研究從采集自活禽交易市場的臨床健康的雞棉拭子中獲得1份陽性樣品，將其命名為A/Chicken/Guangxi/qz40/2009（簡稱qz40），在運用特異引物擴增包含HA全基因在內的序列，并對其進行序列的測定，測序結果拼接后顯示HA基因的cDNA包括一個完整的開放閱讀框，編碼區(qū)由1683 bp組成，共編碼560個氨基酸。經DNAStar軟件將所獲毒株的HA基因序列與從GenBank中獲得的26個H9N2亞型禽流感病毒HA基因核苷酸序列及其推導的氨基酸序列進行同源性比較，結果顯示該毒株與參考毒株的核苷酸序列同源性為82.8%～99.9%，與A/chicken/Guangxi/21/2006株的核苷酸同源性最高；推導氨基酸同源性介于87.5%～99.6%之間。

HA上潛在的糖基化位點對病毒的受體親和力、病毒毒力等多種生物學特性有影響[6]。本研究中qz40株含有7個潛在的N-糖基化位點，其中5個位于HA1部分、2個位于HA2部分，與其他參考株沒有太大的差異。本研究所得的qz40株的HA的裂解位點為RSSR↓GLF，沒有多個連續(xù)的堿性氨基酸插入，具有典型的低致病性禽流感病毒的基因特征[7]。流感病毒HA受體結合位點的特異性決定其感染的宿主范圍。當病毒適應新宿主時，決定受體結合特異性的234位氨基酸通常首先發(fā)生變化[8]。本研究的病毒在該位置為亮氨酸（L），而香港人源H9N2毒株該處氨基酸也為亮氨酸（L）。

研究表明H9N2禽流感主要由2個大的分支，歐亞種系和北美種系。歐亞種系又分為3個群系，分 別 為：A/Chicken/Beijing/1/94（Ck/Bei-like）、A/Quail/HongKong/G1/97（G1-like） 和 A/Duck/HongKong/Y439/97（Y439-like）[1]。本研究中的欽州分離毒株qz40株屬于歐亞種系的A/Chicken/Beijing/1/94（Ck/Bei-like）群系，與國內參考株的親緣關系較近，特別是與分離自廣西的毒株A/chicken/Guangxi/21/2006株處于同一小分支上，這與核苷酸同源性比對結果相符。而與A/Duck/HongKong/Y439/97（Y439-like）群系的親緣關系較遠。

H9N2亞型禽流感病毒雖在亞洲的許多國家流行，各毒株的親緣關系也較近，但有很多因素能影響其HA基因的變異，從而影響其致病力。已有研究表明來自于禽類的H9N2禽流感病毒能偶爾從禽類傳染給哺乳動物，包括人和豬[9]。這種跨種間傳播表明目前的H9N2禽流感病毒對人仍有潛在的感染性。因人類與家禽的接觸機會歷來很多，人類與禽類流感之間的聯系自然非常密切，加之1997年香港禽流感病毒對人類的直接感染[10]，目前對禽流感的公共衛(wèi)生意義的認識日益受到重視。在禽流感所編碼的各種蛋白質中，又以HA基因的突變頻率最高， HA還是禽流感中最主要的保護性抗原，因此本研究就HA基因序列的測定，為H9N2亞型禽流感廣西分離株遺傳變異分析和分子流行病學調查提供了重要材料，也為制訂H9亞型禽流感的綜合防制措施提供了依據，因此建議臨床上在重視H5亞型禽流感感染控制的同時，還應該加強對H9亞型禽流感感染的防控。

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