烏魯木齊某農(nóng)場(chǎng)沙門氏菌的分離鑒定

彭永剛，于 倩，劉建華

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，黑龍江 哈爾濱 150001；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

沙門氏菌是一種腸道桿菌，廣泛存在于各種動(dòng)物及其環(huán)境之中。沙門氏菌病不僅是影響當(dāng)今養(yǎng)禽業(yè)的主要細(xì)菌性疾病[2]，也是一種人畜共患性疾病，可導(dǎo)致嚴(yán)重的食品安全問題[3]。以肺部感染為特征的疾病主要危害 20 日齡以內(nèi)的雞群[4]，0～12 日齡為發(fā)病死亡高峰期[5]。到30 日齡以后 ，癥狀逐步減輕或消失 ，但遺留的弱殘雞 ，使育雛期淘汰率增加。因此，雞舍環(huán)境條件差、密度大、通風(fēng)不良、飼料配合不當(dāng)、營(yíng)養(yǎng)缺乏等亦可引起本病的發(fā)生。

本研究從新疆烏魯木齊某養(yǎng)雞場(chǎng)暴發(fā)的病例的送檢病料中分離到一株疑似沙門氏菌，經(jīng)PCR、生化實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)確診為雞白痢沙門氏菌，并對(duì)其進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，以期為該病的防治提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源

采自某雞場(chǎng)，臨床表現(xiàn)為精神萎頓，食欲減少，同時(shí)腹瀉，排稀薄如漿糊狀糞便，有的病雛出現(xiàn)眼盲，或肢關(guān)節(jié)呈跛行癥狀的患病雛雞。剖檢可見肝腫大，充血或有條紋狀出血，有的心肌、肺、肝、盲腸、大腸及肌胃肌肉中有壞死灶或結(jié)節(jié)。具有明顯病變雛雞的肝臟、心臟、肺等組織作病原分離。

1.1.2 試驗(yàn)材料

普通瓊脂培養(yǎng)基、三糖鐵培養(yǎng)基（TSI）、蛋白胨、葡萄糖蛋白胨、V-P試劑、M-R試劑、藥敏試紙均由雞場(chǎng)微生物實(shí)驗(yàn)室提供，以上試劑均在有效使用期內(nèi)；rTaq、dNTP購(gòu)自大連寶生物公司；Animal Tissue Direct PCR Kit購(gòu)自成都福際生物技術(shù)有限公司；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物20 日齡以內(nèi)的SPF雛雞購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)

采集病、死雞的肝臟、心臟、肺等組織，接種在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng) 18-24h。

1.2.2 涂片、革蘭氏染色及鏡檢

取新鮮可疑菌落，進(jìn)行涂片、革蘭氏染色、鏡檢。

1.2.3 藥敏試驗(yàn)

用滅菌棉拭子蘸取該分離菌營(yíng)養(yǎng)肉湯純培養(yǎng)物，在普通瓊脂培養(yǎng)基表面反復(fù)涂布3次，室溫干燥3-5 min。后用無菌小鑷子將上述抗菌藥物紙片分別貼于培養(yǎng)基表面（每換一種紙片都要滅菌一次鑷子），37 ℃ 培養(yǎng)24 h。根據(jù)藥敏紙片周圍有無抑菌圈及其直徑大小來判斷該菌對(duì)各種藥物的敏感程度，分為高度敏、中度敏感、低度敏感、不敏感（耐藥）沒有抑菌圈。

1.2.4 生化實(shí)驗(yàn)

將分離到的菌按常規(guī)方法進(jìn)行三糖鐵試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、MR試驗(yàn)和 VP試驗(yàn)以及多種糖發(fā)酵試驗(yàn)。

1.2.5 PCR鑒定

參照文獻(xiàn)[6]，設(shè)計(jì)合成沙門氏菌invA基因核苷酸序列引物：invA1：5’-CGGTGGGGTTT GTTGTCTTTTC-3’，invA2： 5’-TCTCTTTCCA GTTCGCTTCGCC-3’、擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為202 bp。引物由上海生工生物工程公司合成。PCR方法參見文獻(xiàn)[6]，PCR產(chǎn)物用Dye terminator Cycle Sequecing Quick Start Kit進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。應(yīng)用DNAStar分析軟件進(jìn)行序列的數(shù)據(jù)編輯，并對(duì)測(cè)序基因的核苷酸進(jìn)行分析。

1.2.5 動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)

取健康雛雞接種后觀察并記錄發(fā)病情況及死亡時(shí)間 ，取接種雞的肝及心血進(jìn)行病原的再分離。

2 結(jié)果

2.1 菌落形態(tài)及培養(yǎng)特性結(jié)果

在瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，肉眼可見形成圓形、隆起、灰白色的半透明菌落。經(jīng)鏡檢發(fā)現(xiàn)該分離菌為無芽孢、直桿狀革蘭氏陰性桿菌（圖1）。

圖1 沙門氏菌菌落形態(tài)

2.2 生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。由表中結(jié)果可見其生化特性與雞白痢沙門氏菌相符。

表1 沙門氏菌生化試驗(yàn)結(jié)果

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)藥敏紙片周圍有無抑菌圈及其直徑大小，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離得到的沙門氏菌對(duì)慶大霉素，氯霉素高度敏感；對(duì)氧氟沙星、環(huán)丙沙星、青霉素、復(fù)方新諾、痢特靈低敏。

2.4 PCR結(jié)果與分析

應(yīng)用設(shè)計(jì)的引物，參照Animal Tissue Direct PCR Kit操作說明進(jìn)行PCR，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在約200bp出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期大小相符（圖2）。PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序分析顯示其與GENEBANK中登錄的雞白痢沙門氏菌invA基因序列同源性99.7%。初步判定其為沙門氏菌。

圖2 PCR結(jié)果

2.5 動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果

將培養(yǎng)菌液接種于雛雞24 h后，出現(xiàn)精神不振、食欲減退等癥狀，最后死亡。解剖死亡雛雞，主要病變有： 肝臟腫大，質(zhì)脆、出血、呈土黃色，有粟粒大灰白色壞死灶，膽囊擴(kuò)張，脾臟腫大、出血，卵黃吸收不良，肺臟充血，出現(xiàn)肺炎等病理變化，將所分離細(xì)菌接種后，24h后長(zhǎng)出與前述分離菌特征一致的細(xì)菌。

3 討論

雞的沙門氏菌病在各日齡均可感染，沙門氏菌還能垂直傳播。若種雞帶菌，則所產(chǎn)種蛋也可帶菌，因此孵化場(chǎng)在種蛋孵化前應(yīng)對(duì)種蛋外殼嚴(yán)格進(jìn)行消毒處理。為防止因雛雞帶菌在注射疫苗時(shí)的交叉感染，因此建議在免疫過程中盡量做到一只雞（或一個(gè)最小單位的雞群）用一個(gè)針頭[7]，以減少病菌的傳播。

本病的發(fā)生與飼養(yǎng)管理有密切關(guān)系 ，如雛群擁擠、溫差過大、通風(fēng)不良、飼料營(yíng)養(yǎng)不全等均可引發(fā)本病。建議加強(qiáng)飼養(yǎng)管理、注意環(huán)境衛(wèi)生 ，并做好隔離、封鎖和消毒工作。購(gòu)買雛雞一定要對(duì)孵化場(chǎng)進(jìn)行考察了解，不要向近期有沙門氏菌污染的孵化場(chǎng)購(gòu)買雛雞，而且對(duì)購(gòu)進(jìn)的雛雞應(yīng)進(jìn)行精心管理，發(fā)現(xiàn)死雛，及時(shí)檢查，查找死亡原因。對(duì)已感染沙門氏菌的雞，要采取果斷措施[8]。作為種雞場(chǎng)，如果飼養(yǎng)數(shù)量不是很多，應(yīng)全群淘汰，并對(duì)雞舍、場(chǎng)地、用具等進(jìn)行徹底清掃，消毒殺菌，雞舍空置2周以上才能引進(jìn)下一批雞。商品雞場(chǎng)若發(fā)現(xiàn)有沙門氏感染雞，應(yīng)及時(shí)淘汰病雞，對(duì)未發(fā)現(xiàn)病雞進(jìn)行藥物預(yù)防。感染沙門氏菌的成年雞雖然能夠產(chǎn)蛋，但所產(chǎn)雞蛋可能帶菌[9]，因此要進(jìn)行殺菌處理，方可出售。

本研究通過PCR克隆了沙門氏菌invA基因序列，該基因高度保守，可作為沙門氏菌的鑒別檢測(cè)，通過序列分析發(fā)現(xiàn)其與雞白痢沙門氏菌invA基因高度同源，可初步判定分離得到的菌株為雞白痢沙門氏菌。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步通過生化實(shí)驗(yàn)，對(duì)照沙門氏菌生化特征，證實(shí)了該菌為雞白痢沙門氏菌。動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)要注意接種動(dòng)物的各種變化，做到勤觀察，包括呼吸狀態(tài)、呼吸式等，對(duì)死亡的實(shí)驗(yàn)雞只要及時(shí)剖檢并做相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。將該菌分離培養(yǎng)后接種雛雞，通過動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)證實(shí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物臨床特征和剖檢病理特征符合該雞場(chǎng)患病雛雞的發(fā)病特征，從而證實(shí)本實(shí)驗(yàn)分離得到的菌種為該雞場(chǎng)暴發(fā)疾病的病原菌。

在實(shí)驗(yàn)過程中，要嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)室相關(guān)要求操作。在配制培養(yǎng)基過程中，要嚴(yán)格按照培養(yǎng)基使用說明配制，必須徹底滅菌，不得含有任何活細(xì)菌，否則配制的培養(yǎng)基無法達(dá)到預(yù)期使用效果[10]。藥敏實(shí)驗(yàn)過程中，用滅菌接種環(huán)致密劃線于瓊脂平板表面時(shí)用力要均勻，接種細(xì)菌量不能過大。將確定好的藥敏紙片分貼到平板表面時(shí)，每個(gè)紙片都應(yīng)輕壓一下，以保證與平板表面完全接觸[12]。藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示分離的沙門氏菌對(duì)慶大霉素、氯霉素高度敏感，是治療該病的首選抗生素。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果確診了該雞場(chǎng)暴發(fā)的疾病病原為雞白痢沙門氏菌，同時(shí)通過藥敏試驗(yàn)得出了防治該病的有效抗生素。本實(shí)驗(yàn)為雞白痢沙門氏菌病的防治提供參考。

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