禽副黏病毒4型熒光RT-PCR檢測方法的建立

王靜靜，劉華雷，王英麗，鄭東霞，趙云玲，呂 艷，左媛媛，于松梅，王志亮

（中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東 青島 266032 ）

禽副黏病毒（APMVs）在分類地位上屬于副黏病毒科副黏病毒亞科禽腮腺炎病毒屬（Avulavirus），其基因組為單股負鏈RNA，可感染多種禽類。目前的研究表明禽副黏病毒至少包括11個血清型，即APMV-1～APMV-11[1-2]。禽副黏病毒1型（APMV-1）也稱為新城疫病毒（NDV），在所有禽副黏病毒中危害最為嚴重。禽副黏病毒4型（APMV-4）于1975年出現于香港地區(qū)的鴨群中[3-4]，此后美國、韓國、比利時、新西蘭等國家也監(jiān)測到該病毒[4-7]。我國大陸地區(qū)于2012年首次報道發(fā)現APMV-4[8]。APMV-4主要感染雁形目鳥類[5]、家鴨、雞和鵝[3，9-10]。蛋雞感染APMV-4后白殼蛋產量增加，但產蛋量不受影響[11]。APMV-4基因組大小約為15054 nt，共編碼6種蛋白：核衣殼蛋白（N）、磷蛋白（P）、基質蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素-神經氨酸酶蛋白（HN）和大聚合酶蛋白（L）。鑒于我國在2012年首次出現APMV-4，因此建立一種APMV-4的快速、靈敏和高效檢測技術在該病毒的早期發(fā)現和快速診斷中意義重大。本研究根據APMV-4的基因組序列，分別設計了針對APMV-4的特異性引物和探針，建立了APMV-4熒光RT-PCR檢測方法，初步應用表明本方法特異性強、敏感性高，可用于APMV-4的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 病毒

Ⅰ類、Ⅱ類新城疫病毒（NDV）、H5、H9亞型禽流感病毒（AIV）、傳染性支氣管炎病毒（IBV）、減蛋綜合征病毒（EDSV）和APMV-4分離株APMV4/Duck/China/G302/2012均為本實驗室保存。

1.2 主要分子生物學試劑

High Pure Viral RNA Kit購 自 Roche公 司；One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit （Perfect Real Time）、PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2購自Takara公司。

1.3 引物與探針的設計合成

根據APMV4/duck/China/G302/2012（GenBank序列號：KC439346）及GenBank上禽副黏病毒4型基因序列，針對相對保守區(qū)域，利用Primer Premier 5.0軟件分別設計了APMV-4的特異性熒光RT-PCR引物和探針，引物、探針的名稱和序列見表1。引物和探針均由寶生物工程（大連）有限公司合成。

表1 熒光RT-PCR引物和探針

1.4 RNA提取

取新鮮繁殖的病毒雞胚尿囊液，采用Roche公司生產的High Pure Viral RNA Kit提取病毒分離株RNA。提取的RNA立即用于RT-PCR擴增或者于-80℃保存。

1.5 熒光RT-PCR

以提取的病毒RNA為模板，采用Takara公司 One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit （Perfect Real Time） 配置熒光RT-PCR反應體系，并于LightCycler定量PCR儀進行RT-PCR反應。反應條件為：42℃ 5min；95℃ 10s；95℃ 5s，60℃30s，進行50個循環(huán)。

1.6 特異性試驗

分別提取NDV（Ⅰ、Ⅱ類）、AIV（H5、H9亞型）、IBV、EDSV以及APMV-4的RNA，進行熒光RT-PCR擴增，并以DEPC處理水作為陰性對照。

1.7 靈敏度試驗

用APMV-4的RNA做10倍系列稀釋，進行熒光RT-PCR擴增。

1.8 常規(guī)RT-PCR

采用APMV-4鑒定引物，利用Takara公司PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2進行常規(guī)RT-PCR 擴 增。 上 游引 物 M1：5′-CAACACTTA CGGGTTTATC-3′；下游引物 M2：5′-CTTCTCGC AGTCTATCTTCT-3′，擴增片段長度為331 bp。反應條件為：50℃反轉錄30min；94℃預變性3min；94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 30s，進行 35個循環(huán)；72℃延伸7min。擴增產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2 結果

2.1 體系優(yōu)化

通過對TaqMan探針濃度、引物濃度、退火溫度和時間進行優(yōu)化后，確定熒光RT-PCR體系的最佳探針濃度為0.2μM、引物濃度為0.4μM、退火溫度和時間為60℃ 30s。用優(yōu)化好的反應體系擴增APMV-4 RNA，并用LightCycler 480軟件進行分析，其擴增曲線呈典型的“S”型（圖2）。

2.2 標準曲線的建立

取5個不同稀釋度的RNA標準品（濃度分別為106～102EID50）進行熒光RT-PCR反應，每個稀釋度的標準品做3個重復。以獲得的Cp值為y軸，對應標準品的EID50的對數為x軸，制作標準曲線（圖1）。標準方程為y = -2.931x + 40.50，相關系數為0.999。

圖1 熒光RT-PCR檢測RNA的標準曲線

2.3 特異性試驗

分別取APMV-4、NDV（Ⅰ、Ⅱ類）、AIV（H5、H9亞型）、IBV、EDSV的RNA，以及DEPC處理水（陰性對照）進行熒光RT-PCR擴增，發(fā)現除APMV-4出現特異性擴增曲線外，其余病毒及陰性對照均沒有擴增曲線（圖2）。

圖2 熒光RT-PCR特異性試驗結果

2.4 靈敏度試驗

取濃度為105～10-1EID50的RNA為模板，進行熒光RT-PCR擴增，發(fā)現APMV-4的檢測下限為1 EID50（圖 3）。

圖3 熒光RT-PCR靈敏度試驗結果

2.5 與常規(guī)RT-PCR敏感性比較

以105～1 EID50的APMV-4 RNA為模板，分別用常規(guī)RT-PCR和熒光RT-PCR擴增，發(fā)現常規(guī)RT-PCR對APMV-4的檢測下限為102EID50（圖4），熒光RT-PCR的檢測下限為1 EID50，比常規(guī)RTPCR的敏感性高100倍左右。

圖4 常規(guī)RT-PCR敏感性檢測結果

3 討論

目前，國外的監(jiān)測數據顯示，已從鴨和鵝等水禽體內分離到APMV-4[4]，而在國內，只是在南方個別省市的監(jiān)測樣品中分離到該病毒。研究顯示，APMV-4可在牛腎細胞（MDBK）、幼倉鼠腎傳代細胞（BHK21）、鴨胚細胞、非洲綠猴腎細胞（Vero）、雞胚成纖維細胞（DF-1）和鵪鶉纖維肉瘤細胞（QT35）等多種細胞系上有效復制，說明該病毒的宿主范圍十分廣泛[12]。然而，目前人們對其病原學、發(fā)病禽類的臨床表現仍不甚明了，而且，該病在家禽中發(fā)病率低，感染禽類的臨床癥狀和剖檢病變不明顯[13]，僅憑肉眼難以判斷，容易出現誤診。目前實驗室常用的APMV-4檢測方法包括病原分離、RT-PCR試驗和血清學試驗（如ELISA）等[5，14]，然而，以上方法操作相對復雜、檢測周期較長，不適用于大規(guī)模的臨床樣品檢測。因此，建立可用于APMV-4快速、靈敏、高效的檢測技術十分必要。

與普通RT-PCR方法相比，熒光RT-PCR操作簡便、檢測時間短，應用該方法檢測APMV-4，從RNA提取到獲得檢測結果可在1.5h內完成，并且在檢測過程中可以進行實時監(jiān)控。熒光RT-PCR方法在結果判定時不需要進行凝膠電泳，不使用溴化乙錠，保障了試驗人員的安全，而且，該方法使用儀器收集熒光判定檢測結果，也避免了主觀因素的影響。

本實驗中，根據APMV-4基因保守區(qū)域設計特異性引物和探針，在進行熒光RT-PCR檢測時，引物和探針的雙重保障使得該方法特異性更強，檢測結果更準確。而且，本實驗應用熒光RT-PCR檢測APMV-4的下限為1 EID50，比常規(guī)RT-PCR的敏感性高100倍左右。實驗證明應用熒光RT-PCR方法檢測APMV-4是可行的，該方法適用于臨床樣本的快速診斷。

熒光RT-PCR也有不足之處，由于其運用了封閉的檢測系統(tǒng)，減少了擴增后的電泳檢測步驟，因而無法監(jiān)測擴增產物的大小[15]，而且APMV-4熒光RT-PCR試劑盒和檢測探針的成本較高，也限制了其廣泛應用于大規(guī)模的流行病學調查。

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