高效液相色譜法測定土霉素片的含量

喬曉芳

（河南省安陽市食品藥品檢驗所，河南 安陽 455000）

高效液相色譜法測定土霉素片的含量

喬曉芳

（河南省安陽市食品藥品檢驗所，河南 安陽 455000）

目的建立土霉素片的含量測定方法。方法高效液相色譜法。采用Luna-C18色譜柱，以0.05 mol/L草酸銨溶液-二甲基甲酰胺-0.2 mol/L磷酸氫二銨（70∶25∶5）為流動相，用紫外檢測器在282 nm波長處檢測。結(jié)果土霉素片濃度在0.01～1 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好（r＝0.9990），平均回收率為100.1%。結(jié)論高效液相色譜法快速、簡便、準確，可用于土霉素片的含量測定。

土霉素片；含量測定；高效液相色譜法；抗生素微生物檢定法

土霉素為四環(huán)素類抗生素。本品為廣譜抑菌劑。土霉素作用機制為藥物能特異性地與細菌核糖體30S亞基的A位置結(jié)合，抑制肽鏈的增長和影響細菌蛋白質(zhì)的合成。用于痢疾、沙眼、結(jié)膜炎、肺炎、中耳炎、皮膚化膿感染等。亦用于治療阿米巴腸炎及腸道感染。土霉素片收載于衛(wèi)生部藥品標準抗生素分冊，其含量測定方法是用抗生素微生物檢定法二劑量法，方法步驟繁瑣，培養(yǎng)時間長[1]。現(xiàn)采用HPLC法，方法簡便、靈敏、準確。

1 儀器與試藥

日本島津LC-2010型高效液相色譜儀（自動進樣器，四元泵，紫外檢測器）；抑菌圈自動測量儀CAM-III。

土霉素對照品（批號：130487-200702，含量為93.6% 中國藥品生物制品檢定所），土霉素片（宜昌人福藥業(yè)有限責任公司，批號20130107 20121203石家莊市協(xié)和藥業(yè)公司批號20130607）；磷酸氫二銨、草酸銨，二甲基甲酰胺、鹽酸均為分析純，水為超純水，空白樣品（是指不含土霉素，其余輔料按制劑壓片）自配。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

WH-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.05 mol/L草酸銨溶液-二甲基甲酰胺-0.2 mol/L磷酸氫二銨（70∶25∶5）；流速：0.9 mL/min，柱溫：30 ℃，檢測波長：282 nm：進樣量：20 μL[1]。

2.2 溶液制備

對照品溶液：精密稱取土霉素對照品約25 mg置25 mL量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸溶液5 mL使溶解后，再加水至刻度，搖勻，制成每l mL含土霉素l mg的溶液，精密量取5 mL置50 mL量瓶中，再用0.01 mol/L鹽酸溶液稀釋至每l mL含土霉素0.1 mg的溶液。

供試品溶液：土霉素片（0.25克/片）取20片精密稱定重量，精密稱取適量（約相當于土霉素25 mg）置25 mL量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸溶液5 mL使溶解后，再加水，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL置50 mL量瓶中，加0.01 mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻即得每l mL含土霉素0.1 mg的溶液。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗

精密稱取土霉素對照品約25 mg置25 mL量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸溶液5 mL使溶解后，再加水至刻度，搖勻，制成每l mL含土霉素l mg的溶液，精密量取5 mL置50 mL量瓶中，再用0.01 mol/L鹽酸溶液稀釋至每l mL含土霉素0.1 mg的溶液，搖勻。在上述色譜條件下，取上述20 μL自動進樣（圖1），計算柱效為6478，分離度符合要求，連續(xù)進樣5次，峰面積的RSD＝0.48%。

2.4 空白干擾試驗

取空白樣品（是指不含土霉素，其余輔料按制劑壓片）按測定方法依法操作，取20 μL自動進樣，記錄色譜圖，未見雜質(zhì)峰（圖2）。

2.5 線性關(guān)系考察

取上述土霉素對照品溶液（1.0 mg/mL），分別用0.01 mol/LHCL配制成0.01、0.025、0.050 、0.075、0.10、0.50、0.75、0.25 mg/mL，共9個濃度系列對照品溶液，分別精密吸取上述對照品溶液各20 μL注入色譜儀自動進樣，按擬定色譜條件測定。得各濃度峰面積，以峰面積為縱座標，濃度為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程：Y＝-2.10636 ×10-3+2.0635×10-9X （r＝0.9999）。結(jié)果表明，土霉素片濃度在0.01～1 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.6 加樣回收試驗

分別精密量取對照品溶液（1 mg/mL）5.00、3.75、2.50 mL置50 mL量瓶中，各加入處方比例量的空白樣品，用0.01 mol/L HCL稀釋至刻度，搖勻，過濾，得0.1、0.075、0.05 mg/mL的溶液，按測定方法依法測定，自動進樣20 μL，計算結(jié)果見表1。

表1 HPLC法測定土霉素片回收實驗結(jié)果（n=3）

圖1 對照品溶液HPLC

2.7 穩(wěn)定性實驗

取0.1 mg/mL對照品溶液重復進樣5次，每次20 μL，峰面積的RSD＝0.48%。上述同一份溶液于0、2、4、6、8 h分別進樣20 μL，測定土霉素峰面積，結(jié)果RSD＝1.2% n＝5）。

2.8 樣品測定

取土霉素片按上述含量測定方法及抗生素微生物法測定法[2]，結(jié)果見表2。

表2 樣品測定HPLC法與微生物法結(jié)果比（n=3）

3 討 論

3.1 色譜柱、流動相及檢測波長，參考鹽酸土霉素含量測定方法。使用C18柱和上述流動相，均有較理想的分離效果及適當?shù)谋Ａ魰r間，測定波長選在282 nm也有滿意的吸收值。本實驗使用進口WH-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）柱效果更理想。

圖2 輔料溶液HPLC

3.2 線性關(guān)系考察

取土霉素對照品配制的0.01～1 mg/mL的9個濃度系列的溶液，測得各點的平均峰面積，并以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標繪制標準曲線，求得回歸方程Y＝-2.10636×10-3+2.0635×10-9X，相關(guān)系數(shù)r為0.9999表明土霉素在0.01～1 mg/mL的濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

3.3 空白干擾試驗：可看出空白樣品在土霉素峰保留時間處（約10 min）無明顯雜峰干擾。

3.4 加樣回收率試驗：從表1數(shù)據(jù)可說明本方法有較好的回收率100.1%。

3.5 穩(wěn)定性試驗，表明本法重復性較好RSD＝0.48%，溶液在8h內(nèi)穩(wěn)定，能滿足測定的要求。

3.6 高效液相色譜法與微生物法比較，從表2數(shù)據(jù)表明HPLC法與抗生素微生物法結(jié)果近似，HPLC法完全可以取代抗生素微生物檢定法。用于土霉素片的含量測定[3]。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[S].北京:化學工業(yè)出版社,2005:462-463.

[2] 中華人民共和國衛(wèi)生部.藥品標準(抗生素藥品第一冊)[S].1989.

[3] 楊開金.紫外分光光度法與抗生素微生物檢定法測定土霉素含量方法比較[J].中國基層醫(yī)藥,2006,13(7):131.

Determination of the Content of Oxytetracycline Tablets by HPLC

QIAO Xiao-fang
(Anyang Institute for Food and Drug Control, Anyang 455000, China)

ObjectiveTo establish a method for determination of the content of Oxytetracycline tablets.MethodsHigh performance liquid chromatography. The WH-C18column, with 0.05 mol/L ammonium oxalate solution - two methyl formamide -0.2 mol/L diammonium hydrogen phosphate (70∶25∶5)as mobile phase, using a UV detector at 282 nm wavelength.ResultsOxytetracycline Tablets concentration relationship in 0.01-1 mg/mL scope with the peak area of linear(r= 0.9990), the average recovery rate was 100.1%.ConclusionThe HPLC method is rapid, simple and accurate, can be used for the content determination of Oxytetracycline tablets.

Oxytetracycline tablets; Content determination; HPLC; Microbiological method

R927.2

B

1671-8194（2014）21-0080-02