三種百合科蔥屬植物對(duì)五種食源性致病菌抑菌效果的比較

馬春景，趙麗華，楊 帆，李繼源，包 斌，*

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306;2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，內(nèi)蒙古呼和浩特010018;3.內(nèi)蒙古鄂爾多斯市生態(tài)環(huán)境職業(yè)學(xué)院，內(nèi)蒙古鄂爾多斯014300)

沙蔥(Allium Mongolicum Regel)，學(xué)名蒙古韭，屬被子植物門(mén)(Angiospermae)，百合科(Liliaceae)，蔥屬(Allium)，為多年生草本旱生植物。分布于我國(guó)新疆、青海、甘肅、寧夏、陜西、內(nèi)蒙古和遼寧［1］。沙蔥具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值［2］，風(fēng)味獨(dú)特，含有2－己烯醛、甲基－2－烯丙基三硫醚［3］等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，沙蔥地上部分可入蒙藥，主治消化不良、不思飲食和禿瘡、青腿病等［4］。

韭菜(Allium Tuberoum)為百合科蔥屬多年生草本植物，又名起陽(yáng)草、壯陽(yáng)草，主要以葉片、假莖供食，是我國(guó)特有的蔬菜之一［5］。韭菜含有豐富的纖維素，可以促進(jìn)腸道蠕動(dòng)、預(yù)防大腸癌的發(fā)生，同時(shí)又能減少對(duì)膽固醇的吸收，從而起到預(yù)防和治療動(dòng)脈硬化、冠心病等疾病的作用［6］;韭菜可治療跌打損傷，有消炎止痛，散瘀止血的功效［7］。此外，韭菜籽具有“溫補(bǔ)肝腎，壯陽(yáng)固精”功效［8］。

大蒜(Allium Sativum)為百合科蔥屬植物，是一種香辛蔬菜，既有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，又有調(diào)味增香和殺菌的作用［9］。大蒜中富含大蒜油，有機(jī)硒，超氧化物歧化酶(SOD)，具有抗病毒抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)作用，并且具有預(yù)防心肌梗塞、血管硬化、抗衰老等的功能［10］。

食源性致病菌導(dǎo)致的疾病是食品安全的關(guān)鍵問(wèn)題，其中動(dòng)物源性食品中金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、大腸桿菌O157∶H7、副溶血弧菌、單增李斯特菌等引起的食源性疾病是食品安全的主要問(wèn)題［11］。目前為止，沒(méi)有文獻(xiàn)就這三種百合科蔥屬植物對(duì)五種常見(jiàn)食源性致病菌的抑菌作用進(jìn)行系統(tǒng)的研究和比較，本文通過(guò)測(cè)定并比較三種百合科蔥屬植物水提取物對(duì)這五種菌的抑制作用，以期為進(jìn)一步探索沙蔥和韭菜在食品安全中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙蔥 采集于內(nèi)蒙古呼和浩特市人工種植新鮮沙蔥，采集后48h內(nèi)運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室;新鮮韭菜和大蒜(白皮) 購(gòu)于當(dāng)?shù)夭耸袌?chǎng);大腸桿菌 O157∶H7(Escherichia coli O157∶H7ATCC43889)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus AB91093)、腸炎沙門(mén)氏菌(Salmonella enteritidi CMCC 50041)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus ATCC33847)、單增李斯特菌(Listeria monocytogenes ATCC19115)均由上海海洋大學(xué)食品學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供;胰蛋白酶大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院＆北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院＆北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

Elix/Rios純水系統(tǒng) 美國(guó)Millipore公司;超聲波清洗機(jī)SK－5200HP 上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司;實(shí)驗(yàn)室高剪切乳化機(jī)上海索維機(jī)電設(shè)備有限公司;臺(tái)式離心機(jī)TDL－40B 上海安亭科學(xué)儀器廠;微量移液器 法國(guó)Gilson公司;恒溫振蕩器DDHZ－300 江蘇太倉(cāng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;SKY－搖床 上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司;高壓滅菌鍋 MLS－3750 SANYO Labo Autoclave;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申生科技有限公司;超凈臺(tái)ACB－4A1(SVE－4A1)上海生叉貿(mào)易有限公司。

1.2 提取液(沙蔥、韭菜和大蒜)的制備

將新鮮原料的泥土及干葉去除后用蒸餾水洗凈，用乙醇(75%)沖洗后再用蒸餾水沖洗至無(wú)乙醇味，九陽(yáng)打漿機(jī)打漿。取漿液100g，放入500mL燒杯中并加入150mL蒸餾水，實(shí)驗(yàn)室高剪切乳化機(jī)進(jìn)行組織破碎，3500r/min離心20min，上清液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮(水浴恒溫45℃，真空)，制成1g/mL(干重)的提取液，裝入離心管中，置于4℃冰箱中保存并當(dāng)天使用，部分提取液樣品在使用前稀釋成0.25g/mL(干重)。

1.3 抑菌實(shí)驗(yàn)

1.3.1 菌種的活化及菌懸液的制備 將5種菌種分別接入對(duì)應(yīng)的斜面培養(yǎng)基(副溶血性弧含3.5%NaCl)上進(jìn)行活化，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。在無(wú)菌條件下，用接種環(huán)挑取活化后的菌體，放入10mL對(duì)應(yīng)的液體培養(yǎng)基(副溶血性弧菌含3.5%NaCl)中，37℃搖床培養(yǎng)12h，取出后進(jìn)行梯度稀釋涂布計(jì)數(shù)。選出菌數(shù)在106cfu/mL的菌液。

1.3.2 濾紙片的制備 用打孔器把定性濾紙打成6mm直徑的圓片，放置于潔凈干燥的培養(yǎng)皿中干熱滅菌。在小濾紙片上滴加提取液，每次滴加10μL，晾干后繼續(xù)滴加提取液，滴加方式見(jiàn)表1。

表1 提取物的滴加方式Table 1 The adding methods of extracts

1.3.3 抑菌活性測(cè)定 每個(gè)平板中加入200μL 106cfu/mL的菌液，倒入20mL左右的已融化并高壓滅菌好的TSA培養(yǎng)基搖勻，待其凝固后將濾紙片等距放入含菌平板(每種菌重復(fù)三次實(shí)驗(yàn))，37℃培養(yǎng)24h后觀察五種菌的生長(zhǎng)情況，用卡尺測(cè)量每一個(gè)抑制圈的直徑(若抑菌圈不規(guī)則取最大直徑與最小直徑的平均值)，取平均值。另設(shè)蒸餾水作對(duì)照。

1.3.4 最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定［12］采用2倍稀釋法，以蒸餾水為溶劑，配置一系列梯度濃度為50、25、12.5、6.25、3.13、1.57、0.78g/L 的提取物稀釋液。用移液槍分別吸取1mL稀釋液加入到平板中，與100μL 106cfu/mL的菌液和20mL培養(yǎng)基充分混勻。待培養(yǎng)基冷卻凝固后，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果，以完全無(wú)菌生長(zhǎng)的最低濃度為最低抑菌濃度。每個(gè)濃度梯度做三個(gè)平行，以蒸餾水作對(duì)照。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析 每一個(gè)處理重復(fù)三次(n=3)。采用Excel軟件分析數(shù)據(jù)并繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙蔥水提取液的抑菌效果

圖1是沙蔥水提物對(duì)五種食源性致病菌的抑制效果。由圖1可知，沙蔥水提取物加樣量小于5μg時(shí)，對(duì)大腸桿菌 O157∶H7、腸炎沙門(mén)氏菌、副溶血性弧菌及金黃色葡萄球菌沒(méi)有抑制作用，對(duì)單增李斯特菌有抑制作用，并且隨著加樣量的增加抑菌圈直徑有所增加。當(dāng)加樣量分別為7.5μg和10μg時(shí)，沙蔥水提物對(duì)三種菌(腸炎沙門(mén)氏菌、副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌)和大腸桿菌O157∶H7開(kāi)始呈現(xiàn)抑制作用;而對(duì)單增李斯特菌而言，提取物加樣量達(dá)到10μg時(shí)，提取物的抑菌作用消失，其原因有待于更進(jìn)一步的研究。當(dāng)沙蔥水提物加樣量大于7.5μg時(shí)，對(duì)大腸桿菌O157∶H7、腸炎沙門(mén)氏菌、副溶血性弧菌及金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑隨著加樣量的增加而增大。當(dāng)加樣量為50μg時(shí)，沙蔥水提物對(duì)五種食源性致病菌的抑菌圈直徑為6.0～41.7mm，其對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性最強(qiáng)(41.7±1.52)mm，大于對(duì)大腸桿菌的抑菌活性(28.7±1.52)mm，此結(jié)果與李亞蕾［13］對(duì)沙蔥提取物的抑菌研究和扈瑞平［14］對(duì)沙蔥鮮汁的抑菌研究結(jié)果是一致的。

2.2 韭菜水提取液的抑菌效果

圖2是韭菜水提物對(duì)5種食源性致病菌的抑制效果。圖2顯示，韭菜水提取物加樣量小于7.5μg時(shí)，對(duì)大腸桿菌O157∶H7、腸炎沙門(mén)氏菌、副溶血性弧菌及金黃色葡萄球菌沒(méi)有抑制作用，對(duì)單增李斯特菌有抑制作用，并且隨著加樣量的增加抑菌圈直徑逐漸增加;當(dāng)加樣量達(dá)到7.5μg時(shí)，韭菜水提物對(duì)腸炎沙門(mén)氏菌及副溶血性弧菌有抑制作用，并且隨著加樣量的增加而增大;對(duì)大腸桿菌O157∶H7和金黃色葡萄球菌沒(méi)有抑制作用;對(duì)單增李斯特菌有抑制作用達(dá)到最大。隨后與沙蔥水提物相似，加樣量為10μg時(shí)，對(duì)單增李斯特菌的抑菌效應(yīng)消失，其原因有待于更進(jìn)一步的研究。當(dāng)加樣量達(dá)到30μg時(shí)，韭菜水提物對(duì)大腸桿菌O157∶H7、金黃色葡萄球菌開(kāi)始呈現(xiàn)抑制作用，并在加樣量增加至50μg時(shí)，抑菌圈直徑進(jìn)一步增加。當(dāng)加樣量為50μg時(shí)，韭菜水提物對(duì)五種食源性致病菌的抑菌圈直徑為6.0～17.7mm，其中對(duì)沙門(mén)氏菌的抑菌活性最強(qiáng)(17.7±0.57)mm;同時(shí)其對(duì)大腸桿菌的抑菌活性(9.3±1.15)mm稍強(qiáng)于對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性(7.6±0.57)mm，此結(jié)果與催亞?wèn)|等［15］用打孔法對(duì)韭菜提取物的抑菌研究結(jié)果不同，催亞?wèn)|等人的研究結(jié)果顯示韭菜鮮汁對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果稍好于對(duì)大腸桿菌的抑菌效果，這可能是由于催亞?wèn)|所用的韭菜鮮汁中抑菌物質(zhì)與本研究所用的韭菜水提物中抑菌物質(zhì)不同所致。

圖2 韭菜水提物對(duì)5種食源性致病菌的抑制效果Fig.2 Inhibitory effects of Allium Tuberoum extract against test strains

2.3 大蒜水提取液的抑菌效果

圖3是大蒜水提物對(duì)5種食源性致病菌的抑制效果。由圖3可知，大蒜水提取物加樣量為2.5μg時(shí)，大蒜水提物對(duì)這五種食源性致病菌均沒(méi)有抑制作用;加樣量增至5μg時(shí)，大蒜水提物對(duì)大腸桿菌O157∶H7、金黃色葡萄球菌及單增李斯特菌開(kāi)始呈現(xiàn)輕微的抑制作用，并且隨著加樣量的增加，抑菌圈直徑增大，而對(duì)沙門(mén)氏菌和副溶血性弧菌沒(méi)有抑制作用;加樣量增至7.5μg時(shí)，對(duì)這五種食源性致病菌均有抑制作用，并且隨著加樣量的增加抑菌活性增大。當(dāng)加樣量為50μg時(shí)，大蒜提取物對(duì)五種食源性致病菌的抑菌圈直徑為18.5～29.3mm，其對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性最強(qiáng)(29.3±2.08)mm。張愛(ài)民［16］的研究表明，大蒜汁對(duì)傷寒沙門(mén)氏菌、痢疾志賀氏菌、及金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的殺滅作用，大腸桿菌的效果次之，與本研究結(jié)果一致。

圖3 大蒜水提物對(duì)5種食源性致病菌的抑制效果Fig.3 Inhibitory effects of A.sativum L.extract against test strains

2.4 三種水提取液的抑菌效果比較

圖4為提取物添加量為50μg時(shí)，三種蔥屬植物的水提物對(duì)五種食源性致病菌的抑制效果比較。由圖4可知，對(duì)于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌和副溶血性弧菌，沙蔥水提物顯示了良好的抑菌活性，其抑菌圈直徑＞大蒜水提物＞韭菜水提物;對(duì)于單增李斯特菌，大蒜水提物有抑菌作用，而沙蔥水提物和韭菜水提物對(duì)單增李斯特菌沒(méi)有抑制作用。許多學(xué)者曾對(duì)大蒜的抑菌作用進(jìn)行過(guò)研究［17］，并確定大蒜素是大蒜的主要抗菌成分［18］，目前大蒜素作為抑菌劑已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、獸藥、食品添加劑、化妝品等行業(yè)［19］。本研究結(jié)果顯示:與大蒜水提物相比，沙蔥水取物對(duì)四種食源性致病菌有較強(qiáng)的抑菌活性，因此沙蔥有可能被開(kāi)發(fā)成為一種新的天然抑菌劑，應(yīng)用于食品安全的控制。盡管目前沒(méi)有研究探討沙蔥中的抑菌成分，但根據(jù)王俊魁等人［3］的研究，沙蔥中含有二烯丙基硫醚，這個(gè)成分對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、福氏志賀氏菌、沙門(mén)氏菌、枯草芽孢桿菌具有一定的抑菌作用［20］，因此這類(lèi)成分有可能是沙蔥水提物抑菌作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖4 三種水提物對(duì)5種食源性致病菌的抑制效果比較Fig.4 Inhibitory effects of three extracts against test strains

2.5 三種蔥屬植物對(duì)五種食源性致病菌的最低抑菌濃度

根據(jù)五種食源性致病菌在含三種蔥屬植物提取物的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀況(表2～表4)確定三種提取物對(duì)五種致病菌的最低抑菌濃度(MIC)。最低抑菌濃度越低，表明菌對(duì)提取物越敏感。大腸桿菌對(duì)沙蔥水提物和大蒜水提物的敏感性一致(MIC 6.25g/L)，強(qiáng)于對(duì)韭菜水提物的敏感性(MIC 25g/L);金黃色葡萄球菌對(duì)大蒜水提物的敏感性最強(qiáng)(MIC 3.13g/L)，對(duì)沙蔥水提物的敏感性次之(MIC 12.5g/L)，對(duì)韭菜水提物的敏感性最弱(MIC 50g/L);沙門(mén)氏菌對(duì)大蒜水提物的敏感性最強(qiáng)(MIC 6.25g/L)，對(duì)沙蔥水提物的敏感性次之(MIC 12.5g/L)，對(duì)韭菜水提物的敏感性最弱(MIC 50g/L);副溶血性弧菌對(duì)大蒜水提物的敏感性最強(qiáng)(MIC 6.25g/L)，對(duì)沙蔥水提物和韭菜水提物的敏感性一致(MIC 12.5g/L);而單增李斯特菌對(duì)這三種蔥屬植物水提物的敏感性相同(MIC 6.25g/L)?？傊宸N致病菌對(duì)大蒜水提物最敏感，其次是沙蔥水提物，而對(duì)韭菜水提物的敏感性最弱。

3 結(jié)論與討論

三種不同水提取物對(duì)這五種食源性致病菌均有一定的抑制作用且具有濃度依賴(lài)性，除了單增李斯特菌外，它們對(duì)其他四種菌的抑制效果隨著提取物的加樣量的增大而增強(qiáng);從抑菌圈直徑來(lái)看，當(dāng)提取物添加量為50μg時(shí)，抑菌效果強(qiáng)弱順序?yàn)樯呈[水提物＞大蒜水提物＞韭菜水提物;從最低抑菌濃度來(lái)看，抑菌敏感性強(qiáng)弱順序?yàn)榇笏馑嵛铮旧呈[水提物＞韭菜水提物。綜上結(jié)果看出，沙蔥的抑菌活性與大蒜相當(dāng)，有望作為一種潛在的抑菌劑應(yīng)用于食品安全領(lǐng)域。

韭菜雖有抗菌能力但遠(yuǎn)不能與大蒜和沙蔥的抗菌作用相比。沙蔥、韭菜和大蒜同是百合科蔥屬植物，造成不同水提物間抑菌結(jié)果的差異以及同種水提物對(duì)不同菌種抑菌結(jié)果的差異原因，與其抑菌機(jī)理及成分相關(guān)，需要通過(guò)進(jìn)一步研究來(lái)闡明。

表2 含沙蔥水提物的培養(yǎng)基中五種食源性致病菌的生長(zhǎng)情況Table 2 The growth of five food－borne bacterial strains in the culture dishes with AMR

表3 含韭菜水提物的培養(yǎng)基中五種食源性致病菌的生長(zhǎng)情況Table 3 The growth of five food－borne bacterial strains in the culture dishes with AT

表4 含大蒜水提物的培養(yǎng)基中五種食源性致病菌的生長(zhǎng)情況Table 4 The growth of five food－borne bacterial strains in the culture dishes with AS

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