酪蛋白磷酸肽副產(chǎn)物中ACEI肽的富集工藝研究

趙力超，寧德山，李雙祁，杜 潔，王 燕，曹 庸，*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州510642;2.無(wú)限極(中國(guó))有限公司，廣東廣州510623;3.廣州綠萃生物科技有限公司，廣東廣州510663)

高血壓是當(dāng)今世界最常見的心血管疾病之一，生活方式和飲食改善是有效降低血壓的重要途徑［1］。隨著人民生活水平的不斷提高和保健意識(shí)的不斷增強(qiáng)，利用功能食品來(lái)調(diào)節(jié)生理狀況的觀點(diǎn)，已越來(lái)越為消費(fèi)者所接受。基于消費(fèi)者對(duì)天然來(lái)源功能因子的追求，以食品為原料開發(fā)降壓功能產(chǎn)品將是未來(lái)預(yù)防、緩解和治療高血壓的一種有效手段。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(Angiotensin-converting enzyme，ACE，EC 3.4.15.1)是一種重要的血壓控制酶，對(duì)其抑制可有效的降低血壓。一些活性肽表現(xiàn)出對(duì)ACE較強(qiáng)的抑制效果，統(tǒng)稱為血管緊張素 I轉(zhuǎn)化酶抑制肽(Angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides，ACEI肽)，食源性ACEI肽是降壓型功能食品中備受關(guān)注的一類產(chǎn)品。

其中，從食物蛋白中獲得ACEI肽，雖然比人工合成的降壓藥物效果弱，但具有以下優(yōu)勢(shì)［2-3］:只對(duì)高血壓患者起作用，對(duì)血壓正常者無(wú)影響，因而不會(huì)產(chǎn)生降血壓過度的問題;經(jīng)食品級(jí)蛋白酶在溫和條件下獲得的，安全性極高，無(wú)副作用;活性多樣性，除降血壓功能外，往往還具有免疫促進(jìn)、抗凝血、易消化吸收、抗腫瘤等功能;具有較好的酸、熱穩(wěn)定性、水溶性和勃度隨濃度變化遲緩等加工優(yōu)點(diǎn)，易于作為功能因子添加到各類食品中。1979年，Oshima首次從食物蛋白質(zhì)分離到食源性ACEI肽［4］后，多種不同食物來(lái)源的ACEI肽相繼被發(fā)現(xiàn)，所涵蓋到的食物蛋白源包括:各種植物蛋白［5-6］，如大豆、菜籽;乳源蛋白［7-8］，如酪蛋白和乳清蛋白;各種肉蛋白［9-10］，如豬肉、魚和雞蛋蛋白;還有大型真菌類［11］，如藻類和蘑菇等。國(guó)外已有多種商業(yè)化的乳源ACE抑制肽制品面市［12-13］，而我國(guó) ACEI肽的商品化尚處于起步階段，國(guó)內(nèi)已有從牛奶、酸奶、玉米、大豆、米糟、雞蛋、魚貝、海藻和肉類等食物蛋白質(zhì)的酶解產(chǎn)物或發(fā)酵制品中發(fā)現(xiàn)ACEI肽的報(bào)道［13］，但市場(chǎng)上仍鮮有相應(yīng)的降血壓產(chǎn)品。究其原因，高活性的ACEI肽產(chǎn)品要求對(duì)蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行反復(fù)的分離提取，目前的產(chǎn)業(yè)化分離純化工藝成本較高。此外，較貴的蛋白來(lái)源也限制了多肽的利用。所以如何利用蛋白產(chǎn)品的副產(chǎn)物，通過簡(jiǎn)單工藝分離富集ACEI肽是今后發(fā)展的重點(diǎn)。

酪蛋白磷酸肽(Casein phosphopeptides，CPPs)是酪蛋白生物活性肽中被研究和開發(fā)最早的一種，具有結(jié)合礦物質(zhì)的作用。也是酪蛋白生物活性肽中研究最多的一種。CPPs生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)過程中，有近80%的蛋白質(zhì)副產(chǎn)物(Casein phosphopeptides byproduct，CPPBP)未被合理利用，作為飼料或廢物棄去，造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。因此，最大程度地開發(fā)CPPBP中的活性肽具有很大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。本文即以CPPBP為原料，定位ACEI肽，研究其量化富集工藝，為其商品化提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

CPPBP 工廠生產(chǎn)CPPs后的雜多肽飽和水溶液，廣州綠萃生物科技有限公司;血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(Angiotensin I-converting enzyme，ACE) 活力單位0.1U/mL，美國(guó) sigma公司;馬尿酰組氨酰亮氨酸(Ⅳ-hippuryl-His-Leu tetrahydrate，HHL) 分析純，美國(guó)sigma公司;胃蛋白酶 活力單位3000U/mg，分析純，廣州市齊云生物技術(shù)有限公司;胰蛋白酶 活力單位250U/mg，分析純，廣州市齊云生物技術(shù)有限公司;乙腈 色譜純，德國(guó) Fisher公司;三氟乙酸(Trifluoroacetic acid，TFA)、馬尿酸(Hippuric acid)色譜純，美國(guó)sigma公司。其他試劑均為分析純。

Diamonsil C18色譜柱 200mm ×4.6mm，5μm，中國(guó)迪馬科技有限公司;LC-10A高效液相色譜儀 日本島津公司;TUS-200恒溫金屬浴 中國(guó)上海一恒科技有限公司;DL-5-B低速離心機(jī) 中國(guó)上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 設(shè)計(jì)及方法

1.2.1 研究思路 以CPPBP為原料，首先利用多肽在不同pH和有機(jī)溶劑條件下溶解度不同的原理對(duì)其進(jìn)行粗分離。通過檢測(cè)各粗分離組分的ACE抑制活性，確定ACEI肽存在部位;其次，通過高效液相法(HPLC法)，精確定位組分中活性單體的位置;最后以活性單體為分離目標(biāo)設(shè)計(jì)正交方案，研究產(chǎn)業(yè)化可行的富集工藝。

1.2.2 ACE抑制活性測(cè)定 參考Cushman［14］的方法并加以改進(jìn)，ACE濃度為0.25U/mL，流動(dòng)相與色譜條件根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件更改為:乙腈∶超純水=25∶75(含0.1%(v/v)TFA)。ACE抑制率結(jié)果計(jì)算如式(1):

式中:R:ACEI樣品對(duì)ACE的抑制率(%)，A:對(duì)照管中馬尿酸的峰面積，B:樣品管中馬尿酸的峰面積，A0:空白管中馬尿酸的峰面積。

1.2.3 粗分離條件研究 分別選擇pH、乙醇濃度、溫度這三個(gè)因素對(duì)CPPBP進(jìn)行粗分離。其中pH選擇2、4、6、8、10、12，6 個(gè)水平;乙醇濃度選擇 10%、30%、50%、70%、90%，5 個(gè)水平;溫度選擇-16、0、4℃，3個(gè)水平。pH、乙醇濃度、溫度分別固定在6、50%、0℃。每個(gè)水平處理1h后，4000r/min下離心30min，記錄沉淀質(zhì)量、上清液體積及上清液水分含量(取上清液凍干，測(cè)含水量)，沉淀60℃下烘干后備用。在單獨(dú)處理的基礎(chǔ)上，選擇具有明顯分離效果的條件進(jìn)行交互處理。按式(2)定量計(jì)算不同因素水平下多肽沉淀得率。

式中:C:沉淀得率(%)，M:沉淀質(zhì)量(g)，V:上清液體積(mL)，W:上清液水分含量(%)。

利用高效液相色譜分析檢測(cè)CPPBP原料及不同因素水平沉淀物中多肽的組成。檢測(cè)條件為:色譜柱:Diamonsil C18(200mm ×4.6mm，5μm);流動(dòng)相:A泵超純水(含0.1%(v/v)TFA)，B泵乙腈(含0.1%(v/v)TFA)，B泵初始濃度為10%;洗脫方式:二元梯度洗脫;0.01～40min，10% ～70%;40.01～45min，90%;流速:1mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng) 214nm;進(jìn)樣量20μL。

對(duì)不同因素水平下的沉淀物進(jìn)行ACE抑制活性檢測(cè)，確定活性多肽粗富集條件。

1.2.4 活性單體的確定 采用分析型高效液相色譜(HPLC)對(duì)1.2.2中活性高的粗富集組分進(jìn)行制備，得到單體。并對(duì)分離到的單峰物質(zhì)進(jìn)行ACEI活性檢測(cè)，確定最高活性單體的出峰時(shí)間，為擴(kuò)大化富集活性組分提供目標(biāo)。制備條件為:色譜柱:Diamonsil C18(200mm×4.6mm，5μm);流動(dòng)相:A 泵超純水(含0.1%(v/v)TFA)，B 泵乙腈(含0.1%(v/v)TFA)，B泵初始濃度為10%;洗脫方式:二元梯度洗脫;0.01～5min，5%～20%;5～50min，20% ～45%;50.01～55min，90%～90%;流速:1mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)214nm;進(jìn)樣量20μL。

1.2.5 ACEI肽量富集工藝的研究 取粗富集組分配成飽和溶液，針對(duì)活性單體的性質(zhì)和出峰時(shí)間，以pH、乙醇濃度、溫度為因素，以沉淀得率、ACE抑制肽含量為響應(yīng)值，在單因素預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)3因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)，通過SPSS軟件分析，確定最佳的ACEI肽擴(kuò)大化富集工藝條件。其中三因素的水平表如表1所示。

表1 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)的因素和水平Table 1 L9(34)Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 以上所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)平行測(cè)定3次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用Statistica6.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 CPPBP的ACE抑制活性

不同濃度CPPBP的ACE抑制率結(jié)果如表2所示。

表2 不同濃度的CPPBP ACE活性抑制率Table 2 ACE-inhibitory activities of different concentrations CPPBP

由表2可知，CPPBP具有ACE抑制活性，且有量效關(guān)系，說(shuō)明CPPBP中含有ACE活性抑制成分。

2.2 ACEI肽粗富集條件研究

采用HPLC法對(duì)CPPBP進(jìn)行多肽組成的測(cè)定，結(jié)果如圖1所示。

圖1 CPPBP的HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatogram of CPPBP

由圖1可知，CPPBP的多肽組成較為復(fù)雜，很難直接確定ACEI肽的部位。欲以此為原料工業(yè)化制備出具有ACE抑制活性的多肽，首先需對(duì)其進(jìn)行粗分離，并要定位活性組分的。

不同水平下pH、乙醇濃度、溫度對(duì)CPPBP粗分離結(jié)果如表3所示。

由表3可知，當(dāng)體系pH在2左右時(shí)，多肽沉淀得率最高，占41.52%，但隨著pH升高，沉淀量顯著降低;當(dāng)乙醇濃度為90%時(shí)，多肽沉淀得率最高，為32.69%，其他條件下得率均很低;溫度方面，低溫對(duì)多肽的沉淀有貢獻(xiàn)，-16℃時(shí)的沉淀率比4℃時(shí)提高64.3%。pH為2的沉淀組分和不同乙醇濃度下的沉淀組分的HPLC譜圖見圖2、圖3。

表3 不同處理?xiàng)l件下沉淀得率Table 3 Precipitation rate under different treatment conditions

圖2 pH2時(shí)沉淀組分的HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatogram of precipitation under pH2

圖3 不同乙醇濃度下的沉淀組分的HPLC圖譜Fig.3 HPLC chromatograms of precipitations under different ethanol concentrations

由圖1與圖2的對(duì)比可知，當(dāng)pH為2時(shí)，體系中沉淀集中在出峰時(shí)間為20～25min，即極性較小的組分被分離開，沉淀記PpH2。而圖1與圖3對(duì)比可知，當(dāng)體系中有50%以上乙醇時(shí)，沉淀集中出峰時(shí)間為10～20min，即極性中等組分得到分離，沉淀記P乙醇。檢測(cè)兩部分沉淀物及上清液的ACE活性抑制率結(jié)果如表4所示。

由表4可知，CPPBP中對(duì)ACE有抑制活性的組分主要為pH為2時(shí)的沉淀組分，考慮到低溫對(duì)多肽有進(jìn)一步富集效果，實(shí)驗(yàn)在pH2和-16℃條件下處理CPPBP溶液，沉淀得率為58.10%，低溫提高沉淀得率將近 28.5%。分離得到的沉淀命名為 P粗，其HPLC圖譜如圖4所示。

表5 100μg/mL P粗中單體的ACE活性抑制率Table 5 ACE-inhibitory activities of 100μg/mL monomers in Pcrude

表4 500μg/mL粗分離組分的ACE活性抑制率Table 4 ACE-inhibitory activities of 500μg/mL preliminary separation components

圖4 P粗組分的HPLC圖譜Fig.4 HPLC spectrogram of Pcrude

由圖4可知，P粗中的多肽還是集中于20～25min之間，低溫對(duì)峰型影響不大。

2.3 ACE抑制肽單體的確定

按1.2.4的方法分離P粗中各多肽單體，并按出峰時(shí)間順序進(jìn)行編號(hào)為P1、P2……，如圖5所示。考慮到P粗中部分多肽含量極微，制備難度較大，后續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)成本過高，因此選取含量相對(duì)比較大的多肽進(jìn)行單體制備。各單體ACE活性抑制率如表5所示。由表5可知，單體P18的ACE活性抑制率最高，100μg/mL濃度下抑制率達(dá)到70%，在其附近的P16次之，但只有20.83%。P16與P18在HPLC圖譜中出峰位置相近，因此量化富集工藝考慮以P16和P18為主要集中目標(biāo)。

圖5 P粗中單體制備的HPLC圖譜Fig.5 HPLC spectrogram of monomers in Pcrude

2.4 擴(kuò)大化富集工藝研究

在前期單因素研究的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)三因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)，以沉淀得率、P16和P18在沉淀中含量這3個(gè)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)分分析。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表6所示，SPSS分析結(jié)果如表7～表8所示。

表6 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 6 Results of orthogonal experiment

利用SPSS軟件對(duì)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，由表7中F值的大小可以看出，pH、乙醇濃度和溫度等3個(gè)因素對(duì)P粗中活性肽的分離均有極顯著影響。影響沉淀率的順序?yàn)?pH＞乙醇濃度＞溫度;影響ACE抑制肽P16含量的順序?yàn)?乙醇濃度＞溫度＞pH;影響ACE抑制肽P18含量的順序?yàn)?乙醇濃度＞pH＞溫度。

表8 估算邊際均值Table 8 Estimate of marginal mean

由SPSS估算邊際均值分析表7中各因變量的均值可知，P粗中ACE抑制肽的沉淀率最大的方案為A1B3C3，P16和P18含量最大的方案均為A1B1C3，由于最優(yōu)方案的差別只在于乙醇濃度，從經(jīng)濟(jì)和活性兩方面出發(fā)，選擇乙醇濃度為70%較佳，因此，均衡考慮各因素水平確定方案為A1B1C3，即pH4、乙醇濃度70%、-20℃。經(jīng)過三次的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，通過該制備工藝可從 P粗沉淀出 33.12%的多肽，其中含有28.07%的ACE抑制肽P16和7.88%的ACE抑制肽P18。綜合第一步工藝得率，ACEI肽二段量化制備工藝最后ACEI肽產(chǎn)物得率為19.11%。經(jīng)活性測(cè)定，最終產(chǎn)品的ACE抑制率為46.29%(500μg/mL)。

表7 主體間效應(yīng)的檢驗(yàn)Table 7 Tests of inter-subject effects

3 結(jié)論

研究CPPBP的分離特性，分析其中各性質(zhì)組分多肽的組成。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，具有明顯粗分離效果的因素為pH2(溶液中極性較小組分沉淀而得到分離)、50%以上乙醇濃度(溶液中極性中等組分沉淀而得到分離)，而溫度降低具有使各沉淀組分富集效果，-16℃最佳。而CPPBP中對(duì)ACE有抑制活性的組分主要集中在等電點(diǎn)為2和-16℃保存后沉淀部分。同時(shí)對(duì)粗富集物中各單體進(jìn)行ACE抑制活性測(cè)定，得到單體P18的ACE抑制活性最高，其次為單體P16，并通過HPLC法定位兩個(gè)單體的位置。

設(shè)計(jì)ACEI肽二段量化富集工藝。第一段即以CPPBP飽和多肽液為原料，設(shè)定沉淀?xiàng)l件為pH2、-16℃、沉淀1h，得到粗富集物(P粗)。第二段經(jīng)過三因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)，確定制備工藝為pH4、乙醇濃度70%、-20℃條件下，沉淀1h。最后二段量化富集工藝的ACEI肽產(chǎn)物得率為19.11%。經(jīng)活性測(cè)定，500μg/mL產(chǎn)品的ACE抑制率為46.29%。

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