MR-1通過(guò)抑制PERK/Nrf2途徑減輕缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡*

陶天琪，王曉礽，徐菲菲，劉蜜，李玉珍，劉秀華

(中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院病理生理研究室，北京 100853)

·論著·

MR-1通過(guò)抑制PERK/Nrf2途徑減輕缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡*

陶天琪，王曉礽，徐菲菲，劉蜜，李玉珍，劉秀華△

(中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院病理生理研究室，北京 100853)

目的:研究肌原纖維形成調(diào)節(jié)因子1(MR-1)是否通過(guò)抑制蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)/核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)途徑減輕缺氧/復(fù)氧(H/R)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。方法：在原代培養(yǎng)的乳大鼠心肌細(xì)胞H/R模型上，采用Annexin V/PI雙標(biāo)法檢測(cè)心肌細(xì)胞的凋亡率;以Western blotting檢測(cè)葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78 (GRP78)、磷酸化PERK、Nrf2、活化轉(zhuǎn)錄因子4(ATF4)、C/EBP同源蛋白(CHOP)、Bcl-2和Bax的蛋白水平，研究過(guò)表達(dá)或敲低對(duì)于H/R致心肌細(xì)胞凋亡的影響及其與PERK/Nrf2途徑活化的關(guān)系。結(jié)果:H/R引起心肌細(xì)胞凋亡;過(guò)表達(dá)MR-1減輕H/R引起的細(xì)胞凋亡(P＜0.01)，下調(diào)CHOP表達(dá)(P＜0.05)，引起B(yǎng)cl-2/Bax值升高(P＜0.01)，并抑制H/R誘導(dǎo)的PERK磷酸化、Nrf2核轉(zhuǎn)位和ATF4表達(dá)(P＜0.01)。敲低MR-1加重H/R引起的細(xì)胞凋亡(P＜0.01)、CHOP表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)和Bcl-2/Bax值下降(P＜0.01)，并加重H/R誘導(dǎo)的PERK磷酸化(P＜0.05)、Nrf2核轉(zhuǎn)位和ATF4表達(dá)(P＜0.01)。結(jié)論:MR-1通過(guò)抑制PERK/Nrf2途徑而減輕缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞凋亡;缺氧/復(fù)氧;心肌細(xì)胞;肌原纖維形成調(diào)節(jié)因子1;蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)激酶;核因子E2相關(guān)因子2

缺血性疾病是嚴(yán)重危害人類健康的常見(jiàn)?。?］，盡早恢復(fù)組織血供是防治缺血損傷最有效的措施。但缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷所致的心肌細(xì)胞凋亡、壞死、惡性心律失常和心功能障礙嚴(yán)重影響再灌注療法療效和患者預(yù)后，是心血管領(lǐng)域亟待解決的重大問(wèn)題。其中再灌注損傷誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡是造成心肌梗死面積擴(kuò)展、心功能障礙的重要因素，闡明調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制將為缺血再灌注的防治提供新靶點(diǎn)［1］。肌原纖維形成調(diào)節(jié)因子1(myofibrillogenesis regulator 1，MR-1)是課題組從人類骨骼肌cDNA文庫(kù)克隆出的人類新功能基因(AF417001)，定位于人類染色體2q35，mRNA全長(zhǎng)755 bp，編碼一段142個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，在心肌、骨骼肌、腎臟和肝臟中高表達(dá)［2-4］。課題組前期工作證實(shí)，MR-1定位于心肌細(xì)胞漿的肌原纖維，缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)時(shí)心肌細(xì)胞MR-1表達(dá)下調(diào);過(guò)表達(dá)MR-1明顯減輕H/R導(dǎo)致的腎小管上皮細(xì)胞凋亡，提示MR-1具有抗細(xì)胞凋亡的作用，其機(jī)制尚待闡明。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是細(xì)胞應(yīng)激的最初反應(yīng)，可以整合并啟動(dòng)線粒體和細(xì)胞核反應(yīng)，過(guò)度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡主要通過(guò)蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)介導(dǎo)的C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)途徑、肌醇需求酶1(inositol-requiring enzyme 1，IRE1)介導(dǎo)的caspase-12［5］和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)［6］途徑所介導(dǎo)。其中PERK通過(guò)激活真核細(xì)胞起始因子2(eukaryotic initiator factor 2α，eIF2α)上調(diào)活化轉(zhuǎn)錄因子4(activating transcription factor 4，ATF4)，增加CHOP的表達(dá)，導(dǎo)致抑凋亡因子Bcl-2蛋白下調(diào)和促凋亡因子Bax蛋白上調(diào)，引起細(xì)胞凋亡［7］。我們既往的工作證實(shí)H/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重的ERS反應(yīng)，表現(xiàn)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)和PERK表達(dá)上調(diào)，ERS相關(guān)細(xì)胞凋亡分子CHOP及其下游分子Bcl-2表達(dá)下調(diào)，Bax表達(dá)上調(diào)［8-9］，提示PERK途徑是介導(dǎo)H/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的重要信號(hào)途徑。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)在生理狀態(tài)下位于細(xì)胞漿內(nèi)的細(xì)胞骨架。既往研究證實(shí)I/R誘導(dǎo)Nrf2胞核轉(zhuǎn)位，與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response elements，AREs)相關(guān)靶基因的啟動(dòng)子結(jié)合，促使抗氧化蛋白及酶類如NAD(P)H的基因轉(zhuǎn)錄增加，減輕氧化反應(yīng)［10］。最近發(fā)現(xiàn)，Nrf2還是PERK的下游底物［6］，I/R誘導(dǎo)核轉(zhuǎn)位的Nrf2在細(xì)胞核內(nèi)大量聚集［10］，通過(guò)作用于ATF4啟動(dòng)子，上調(diào)ATF4的轉(zhuǎn)錄水平［11］，從而正反饋調(diào)節(jié)PERK途徑凋亡相關(guān)分子ATF4，提示PERK介導(dǎo)的Nrf2/ATF4相關(guān)信號(hào)途徑可能是I/R誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制。本工作以體外培養(yǎng)的乳大鼠心肌細(xì)胞缺氧8 h/復(fù)氧16 h模型模擬在體心肌I/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，分別以腺病毒感染過(guò)表達(dá)和穩(wěn)定型小干擾RNA(stealth siRNA，st-RNA)轉(zhuǎn)染技術(shù)敲低MR-1表達(dá)，研究其對(duì)H/ R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和PERK介導(dǎo)的Nrf2/ATF4信號(hào)途徑的影響，旨在證實(shí)MR-1通過(guò)抑制PERK介導(dǎo)的Nrf2/ATF4相關(guān)信號(hào)途徑減輕H/R導(dǎo)致的心肌細(xì)胞細(xì)胞凋亡，為心肌I/R的防治提供新途徑。

材料和方法

1 動(dòng)物與試劑

清潔級(jí)SD乳鼠(出生24 h內(nèi))購(gòu)自北京市軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco;新生牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料研究所;胰蛋白酶、蛋白酶抑制劑和Triton X-100購(gòu)自Sigma;Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Annexin V-FITC Apoptosis Direction Kit)購(gòu)自南京凱基生物工程公司;蛋白電泳分子量(7～175 kD)標(biāo)記為Bio-Rad產(chǎn)品;蛋白定量試劑盒購(gòu)自康威世紀(jì)公司;脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen;兔抗人GRP78、PERK、Bcl-2、Bax多克隆抗體、兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)單克隆抗體和小鼠抗人CHOP單克隆抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology;兔抗人磷酸化PERK(p-PERK)、ATF4和Nrf2多克隆抗體，Texas red-conjugated驢抗兔抗體，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑盒購(gòu)自Santa Cruz;辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG購(gòu)自Epitomics;胞漿胞核蛋白分離提取試劑盒購(gòu)自Thermo Fisher Scientific;含DAPI的抗淬滅封片劑購(gòu)自Vector Laboratories;牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)購(gòu)自Merck;其余化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

2 乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)與分組

按我們報(bào)道的方法［12］培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞:出生24 h內(nèi)乳大鼠常規(guī)消毒后無(wú)菌操作取出心尖部組織，立即在4℃無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffered saline，PBS)中洗去殘血，分離附著組織后，剪成約1 mm×1 mm×1 mm大小碎塊，經(jīng)0.15%胰蛋白酶37℃反復(fù)消化，制備心肌細(xì)胞懸液，用含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋成細(xì)胞密度為3×109/L，接種于75 mm2培養(yǎng)瓶中，置37℃、5% CO2孵箱中進(jìn)行原代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前24 h更換無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，進(jìn)行同步化處理后，隨機(jī)分為以下7 組:(1)正常對(duì)照組(control):正常連續(xù)培養(yǎng)48 h; (2)缺氧/復(fù)氧組(H/R):心肌細(xì)胞置于三氣培養(yǎng)箱缺氧8 h(37℃，O2含量5%，N2含量90%，CO2含量5%)，后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱復(fù)氧培養(yǎng)16 h結(jié)束實(shí)驗(yàn);(3)MR-1過(guò)表達(dá)組(Ad-MR-1):以構(gòu)建的MR-1重組腺病毒Ad-MR-1感染細(xì)胞，使感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI;即:加入病毒總數(shù)/細(xì)胞總數(shù))為50 pfu，感染48 h后結(jié)束實(shí)驗(yàn);(4) MR-1敲低組(st-MR-1):針對(duì)rat MR-1(NM_ 001134753.1)設(shè)計(jì)并篩選出25 bp的st-RNA，以50 nmol/L轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染方法見(jiàn)下述，轉(zhuǎn)染5 h后更換有血清DMEM培養(yǎng)液;(5)MR-1過(guò)表達(dá)+缺氧/復(fù)氧組(Ad-MR-1+H/R):按照(3)組方法以Ad-MR-1感染細(xì)胞20 h后更換無(wú)血清DMEM，再按照(2)組程序操作;(6)MR-1敲低+缺氧/復(fù)氧組(st-MR-1 +H/R):按照(4)組方法轉(zhuǎn)染st-MR-1，轉(zhuǎn)染后20 h更換無(wú)血清DMEM，再按照(2)組程序操作;(7)隨機(jī)25 bp雙鏈RNA轉(zhuǎn)染對(duì)照組(mock):隨機(jī)合成25 bp且GC含量與st-MR-1一致的雙鏈st-RNA，按照(4)組方法轉(zhuǎn)染操作。

3 腺病毒的包裝與感染

按照文獻(xiàn)報(bào)道方法從質(zhì)粒pcDNA3.1-hMR-1［13］中擴(kuò)增目的基因MR-1，委托Invitrogen公司構(gòu)建包裝含有MR-1全長(zhǎng)的重組腺病毒Ad-MR-1，結(jié)果測(cè)定病毒滴度為3.3×1012pfu/L。以該病毒原液感染生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的細(xì)胞，感染前更換有血清的DMEM培養(yǎng)液，每1×105個(gè)細(xì)胞約加入病毒液10 μL，使感染復(fù)數(shù)約為50 pfu，感染48 h后結(jié)束實(shí)驗(yàn)。

4 st-RNA的構(gòu)建與轉(zhuǎn)染

針對(duì)rat MR-1(NM_001134753.1)設(shè)計(jì)并篩選出25bp的st-RNA(st-MR-1)，序列為5’-CGACAGCUAACAAGGCUUCCCAGAA-3’，以50 nmol/L轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染方法參照Lipofectamin 2000試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，轉(zhuǎn)染5 h后更換有血清DMEM培養(yǎng)液15 h后更換無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液。

5 Annexin V/PI雙標(biāo)法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

培養(yǎng)的乳大鼠心肌細(xì)胞以1×104/cm2的密度接種于25 mm2培養(yǎng)皿，參照Annexin V-FITC Apoptosis Direction Kit說(shuō)明書(shū)的方法進(jìn)行檢測(cè):實(shí)驗(yàn)處理結(jié)束后以含EDTA的0.25%胰酶消化并收集細(xì)胞，以0.01 mol/L PBS離心洗滌細(xì)胞2次(3 000 r/min離心30 s)，洗滌后的沉淀以500 μL Binding Buffer懸浮均勻，分別加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，充分混合均勻，室溫下避光孵育10 min后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)早期凋亡率和晚期凋亡率之和。

6 Nrf2細(xì)胞熒光染色

細(xì)胞以1×104/cm2的密度接種于包被有明膠的蓋玻片，實(shí)驗(yàn)處理后以PBS洗滌3次，-20℃預(yù)冷的冰甲醇預(yù)固定5 min，4%多聚甲醛固定15 min，以含有0.1%Triton X-100、含1%BSA的PBS在室溫下封閉50 min，以1%BSA配制Ⅰ抗工作液:多克隆兔抗人Nrf2(1∶40)，室溫下Ⅰ抗工作液孵育1 h，PBS洗滌10 min×3次，以PBS配制Ⅱ抗工作液: Texas red-conjugated驢抗兔(1∶200)。Ⅱ抗工作液于室溫下避光孵育1 h，以PBS洗滌10 min×3次，用含DAPI的抗淬滅封片劑封片，激光掃描共聚焦顯微鏡(Zeiss LSM-510 Meta)觀察并采集圖像。

7 Nrf2胞漿胞核蛋白分離與蛋白定量

按照胞漿胞核蛋白分離提取試劑盒的操作步驟進(jìn)行，以BCA法進(jìn)行蛋白定量。

8 免疫印跡法

取含有80 μg蛋白進(jìn)行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后以半干式法電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，0.01mol/L TBST(20 mmol/L Tris-HCl，137 mmol/L NaCl，0.01%Tween-20，pH 7.5)配制的5%BSA室溫封閉，加入Ⅰ抗于4℃過(guò)夜雜交，不同抗體的稀釋度分別為:anti Bcl-2(1∶1 000)，anti Bax(1∶1 000)，anti CHOP(1∶500)，anti ATF4(1∶200)，anti Nrf2 (1∶100)，antip-PERK(1∶500)，antiPERK (1∶1 000)，anti GRP78(1∶500)，anti GAPDH (1∶1 000);加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗(TBST配制，1∶1 000)，室溫作用2 h后以ECL試劑盒發(fā)光顯影。以圖像分析軟件Image-Pro Plus測(cè)量各組條帶積分吸光度(integrated absorbance，IA;IA=mean absorbance×area)進(jìn)行半定量分析，并與內(nèi)參照GAPDH的IA值進(jìn)行比較。

9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用單因素方差分析(Oneway ANOVA)進(jìn)行組間比較，采用q檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較;對(duì)胞核Nrf2蛋白量與ATF4蛋白量進(jìn)行相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 MR-1減輕H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的結(jié)果見(jiàn)圖1。缺氧8 h/復(fù)氧16 h(H/R組)心肌細(xì)胞凋亡率較正常對(duì)照組高［(12.1±2.2)%vs(6.3±1.1)%，P＜0.01］。與正常對(duì)照組比較，重組腺病毒Ad-MR-1感染心肌細(xì)胞48 h致MR-1過(guò)表達(dá)的Ad-MR-1組細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯改變(P＞0.05);但MR-1過(guò)表達(dá)明顯抑制心肌細(xì)胞H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡增加［(9.1 ±1.5)%vs(12.1±2.2)%，P＜0.01］。以st-RNA敲低MR-1表達(dá)后誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡［(15.9± 2.1)%vs(12.0±1.1)%，P＜0.01］;與單純H/R組比較，MR-1敲低加重H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡［(17.2±0.8)%vs(12.1±2.2)%，P＜0.01］。上述結(jié)果提示MR-1具有抑制H/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的作用。

Figure 1.Myofibrillogenesis regulator 1(MR-1)reduced apoptosis induced by hypoxia/reoxygenation(H/R)in vitro as determined by flow cytometric analysis of Annexin V and propidium iodide(PI)double-stained cardiomyocytes.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs H/R;＆P＜0.05 vs mock.圖1 Annexin V/PI雙染的流式細(xì)胞術(shù)分析MR-1對(duì)H/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的影響

2 MR-1減輕H/R誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其相關(guān)細(xì)胞凋亡

Western blotting檢測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子GRP78的結(jié)果見(jiàn)圖2。與正常對(duì)照組比較，H/ R組GRP78蛋白表達(dá)高1.1倍(P＜0.01)，提示H/R可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。Ad-MR-1組GRP78蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組高1倍(P＜0.01)，與H/R組無(wú)顯著差異(P＞0.05)，但是MR-1過(guò)表達(dá)減輕了H/R誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子GRP78蛋白表達(dá)，表現(xiàn)為Ad-MR-1+H/R組GRP78蛋白表達(dá)較H/R組低14.2%(P＜0.01)，提示單純過(guò)表達(dá)MR-1可產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，而MR-1過(guò)表達(dá)減輕了H/R誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。Mock組GRP78蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組高61.7%(P＜0.01)，而敲低MR-1(st-MR-1 組)GRP78蛋白表達(dá)較Mock組高21.2%(P＜0.01);敲低MR-1的心肌細(xì)胞在H/R后(st-MR-1+H/R組) GRP78蛋白表達(dá)較H/R組高5.6%(P＜0.05)，提示敲低MR-1本身可以誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，并進(jìn)一步加重H/R誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。

Figure 2.Myofibrillogenesis regulator 1(MR-1)reduced the expression of GRP78 in H/R-treated cardiomyocytes.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs H/R;＆P＜0.05 vs mock.圖2 MR-1對(duì)H/R心肌細(xì)胞GRP78蛋白表達(dá)的影響

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)細(xì)胞凋亡分子CHOP表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3。與正常對(duì)照組比較，H/R組CHOP蛋白表達(dá)高16.0%(P＜0.01)，提示H/R可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)細(xì)胞凋亡;單純過(guò)表達(dá)MR-1對(duì)CHOP蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響(P＞0.05)，但是過(guò)表達(dá)MR-1卻減少H/R誘導(dǎo)的CHOP蛋白表達(dá)，表現(xiàn)為CHOP蛋白表達(dá)較H/R組低9.9%(P＜0.05)，提示MR-1過(guò)表達(dá)明顯抑制H/R誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)細(xì)胞凋亡。Mock組心肌細(xì)胞CHOP蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組高14.2%(P＜0.01);與mock組比較，st-MR-1組心肌細(xì)胞CHOP蛋白表達(dá)高8.6%(P＜0.01);敲低MR-1的心肌細(xì)胞行H/R后CHOP蛋白表達(dá)較H/R組高5.1%(P＜0.05)，提示敲低MR-1本身可以誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的細(xì)胞凋亡，并進(jìn)一步加重H/R誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的細(xì)胞凋亡。

Figure 3.Effect of myofibrillogenesis regulator 1(MR-1)on the expression of ERS-related apoptotic protein CHOP in H/R-treated cardiomyocytes.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs H/R;＆P＜0.05 vs mock.圖3 MR-1對(duì)H/R心肌細(xì)胞CHOP蛋白表達(dá)的影響

進(jìn)一步分析CHOP下游促凋亡因子Bax蛋白和抗凋亡因子Bcl-2蛋白表達(dá)的結(jié)果見(jiàn)圖4。與正常對(duì)照組比較，H/R組抑凋亡因子Bcl-2蛋白表達(dá)低20.6%，促凋亡因子Bax蛋白表達(dá)高18.9%，Bcl-2/ Bax值低33.2%(P＜0.01)，提示H/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)細(xì)胞凋亡的CHOP途徑活化。單純過(guò)表達(dá)MR-1的Ad-MR-1組Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)無(wú)顯著差異(P＞0.05)，但卻明顯影響H/R誘導(dǎo)的CHOP下游促凋亡因子Bax蛋白和抗凋亡因子Bcl-2蛋白表達(dá)。與H/R組比較，Ad-MR-1+H/R組Bcl-2蛋白表達(dá)高29.3%，Bax蛋白表達(dá)低15.9%，Bcl-2/Bax值高53.7%(P＜0.01)，提示MR-1過(guò)表達(dá)可以減輕H/R誘導(dǎo)的CHOP凋亡途徑活化。與正常對(duì)照組比較，mock組Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)分別高23.4%和20.8%，Bcl-2/Bax值低15.2%(P＜0.01)，st-MR-1組Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)較mock組分別低41.0%和18.8%(P＜0.05)，但Bcl-2/Bax值低27.3%(P＜0.01);敲低MR-1進(jìn)一步加重H/ R誘導(dǎo)的Bcl-2下調(diào)和Bax上調(diào)，表現(xiàn)為與H/R組比較，st-MR-1+H/R組心肌細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)降低25.4%，Bax蛋白表達(dá)增高26.2%，Bcl-2/Bax值降低28.8%(P＜0.01)，提示敲低MR-1本身可以誘導(dǎo)CHOP凋亡途徑活化，并進(jìn)一步加重H/R誘導(dǎo)的CHOP凋亡途徑活化。

Figure 4.Effect of myofibrillogenesis regulator 1(MR-1)on the expression of anti-apoptotic protein Bcl-2 and proapoptotic protein Bax，and Bcl-2/Bax ratio in H/R-induced cardiomyocytes.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs H/R;＆P＜0.05 vs mock.圖4 MR-1對(duì)H/R心肌細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)及Bcl-2/Bax值的影響

3 MR-1通過(guò)PERK/Nrf2途徑減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)細(xì)胞凋亡

3.1 MR-1抑制H/R誘導(dǎo)的PERK磷酸化Western blotting檢測(cè)心肌細(xì)胞PERK表達(dá)與磷酸化的結(jié)果見(jiàn)圖5。H/R明顯上調(diào)PERK表達(dá)及其磷酸化，其PERK蛋白表達(dá)和磷酸化水平分別較正常對(duì)照組高24.6%和100%(P＜0.01)，提示H/R上調(diào)PERK蛋白表達(dá)和磷酸化，其中磷酸化上調(diào)更為明顯。單純過(guò)表達(dá)MR-1的Ad-MR-1組PERK蛋白表達(dá)和磷酸化水平較正常對(duì)照組無(wú)顯著差異(P＞0.05);而過(guò)表達(dá)MR-1后行H/R的心肌細(xì)胞，盡管其PERK蛋白表達(dá)較H/R組高18.5%(P＜0.05)，卻明顯下調(diào)PERK磷酸化水平，其PERK磷酸化水平較H/R組低56.5%(P＜0.01)，提示單純過(guò)表達(dá)MR-1對(duì)PERK的蛋白表達(dá)和磷酸化無(wú)明顯影響，但明顯抑制H/R誘導(dǎo)的PERK磷酸化上調(diào)。與正常對(duì)照組比較，mock組PERK蛋白表達(dá)無(wú)顯著差異(P＞0.05)，但其磷酸化水平高22.1%(P＜0.01);與mock組比較，單純敲低MR-1的st-MR-1組PERK蛋白表達(dá)和磷酸化水平分別高17.7%和35.0%(P＜0.01)，而與H/R組比較，敲低MR-1的心肌細(xì)胞在H/R后其PERK蛋白表達(dá)無(wú)明顯改變(P＞0.05)，但PERK磷酸化水平高2.5%(P＜0.05)，提示敲低MR-1本身可以誘導(dǎo)PERK磷酸化，并進(jìn)一步上調(diào)H/R誘導(dǎo)的PERK磷酸化。

Figure 5.Myofibrillogenesis regulator 1(MR-1)reduced the phosphorylation of PERK in H/R-treated cardiomyocytes.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs H/R;＆P＜0.05 vs mock.圖5 MR-1對(duì)H/R心肌細(xì)胞PERK磷酸化的影響

3.2 MR-1抑制H/R誘導(dǎo)的Nrf2核轉(zhuǎn)位采用細(xì)胞免疫熒光染色檢測(cè)PERK下游分子Nrf2亞細(xì)胞分布的結(jié)果見(jiàn)圖6A。正常對(duì)照組Nrf2蛋白主要均勻分布于胞漿，胞核內(nèi)少量均勻分布。與正常對(duì)照組比較，H/R組心肌細(xì)胞內(nèi)Nrf2出現(xiàn)明顯的核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象，Nrf2主要集聚在細(xì)胞核內(nèi)和核周，且在核內(nèi)呈團(tuán)塊狀分布;單純過(guò)表達(dá)MR-1對(duì)Nrf2亞細(xì)胞分布無(wú)明顯影響，表現(xiàn)為Ad-MR-1組Nrf2在心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)均勻分布，少量均勻分布在核內(nèi)，與正常對(duì)照組類似;但過(guò)表達(dá)MR-1明顯減輕H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞Nrf2核轉(zhuǎn)位，表現(xiàn)為Ad-MR-1+H/R組心肌細(xì)胞內(nèi)Nrf2均勻分布于胞漿，少量Nrf2均勻分布于核內(nèi);與正常對(duì)照組比較，mock組Nrf2在胞漿和胞核內(nèi)均勻分布，但在少數(shù)細(xì)胞的核內(nèi)呈團(tuán)塊狀分布;與mock組比較，敲低MR-1后心肌細(xì)胞Nrf2集中分布在核內(nèi)和核周，提示敲低MR-1可以造成Nrf2核轉(zhuǎn)位，且敲低MR-1進(jìn)一步加重H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞Nrf2核轉(zhuǎn)位，表現(xiàn)為st-MR-1+H/R組心肌細(xì)胞內(nèi)Nrf2團(tuán)塊狀積聚于胞核內(nèi)和核周，極少量分布于胞漿。上述結(jié)果表明，H/R造成Nrf2核轉(zhuǎn)位，過(guò)表達(dá)MR-1明顯減輕H/R誘導(dǎo)的Nrf2核轉(zhuǎn)位，敲低MR-1加重H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞Nrf2核轉(zhuǎn)位。

Western blotting檢測(cè)Nrf2胞漿與胞核組分蛋白的結(jié)果見(jiàn)圖6B、C。正常對(duì)照組心肌細(xì)胞胞漿和胞核中均存在Nrf2蛋白。H/R組Nrf2胞核組分蛋白較正常對(duì)照組高47.9%(P＜0.01)，胞漿組分蛋白無(wú)明顯改變(P＞0.05)，提示H/R增加Nrf2蛋白的表達(dá)并誘導(dǎo)其核轉(zhuǎn)位。單純過(guò)表達(dá)MR-1對(duì)心肌細(xì)胞Nrf2胞核組分蛋白無(wú)明顯影響(P＞0.05)，但胞漿組分蛋白較正常對(duì)照組高32.5%(P＜0.01);與H/R組比較，過(guò)表達(dá)MR-1后行H/R的心肌細(xì)胞，盡管其胞漿組分蛋白較H/R組高1.2倍，但是明顯減少了H/R誘導(dǎo)的Nrf2胞核組分蛋白上調(diào)，其Nrf2胞核組分蛋白較H/R低30.6%(P＜0.01)，提示過(guò)表達(dá)MR-1增加Nrf2蛋白在胞漿的分布，但抑制H/R誘導(dǎo)的Nrf2核轉(zhuǎn)位。與正常對(duì)照組比較，mock組的Nrf2胞核和胞漿組分均升高，表現(xiàn)為胞核組分蛋白高31.4%，胞漿組分蛋白高25.7%(P＜0.01);與mock組比較，敲低MR-1僅引起Nrf2胞核組分蛋白上調(diào)，表現(xiàn)為Nrf2胞核組分蛋白高18.5%(P＜0.01)，胞漿組分無(wú)顯著差異(P＞0.05);敲低MR-1進(jìn)一步加重H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞Nrf2胞核組分蛋白上調(diào)，表現(xiàn)為st-MR-1+H/R組心肌細(xì)胞核Nrf2蛋白較H/R組高36.1%(P＜0.01)，但對(duì)胞漿組分無(wú)明顯影響(P＞0.05)，提示敲低MR-1進(jìn)一步上調(diào)H/R誘導(dǎo)的Nrf2胞核組分蛋白，加重H/R誘導(dǎo)的Nrf2核轉(zhuǎn)位。

3.3 MR-1抑制H/R誘導(dǎo)的Nrf2下游分子ATF4表達(dá)上調(diào)Western blotting檢測(cè)Nrf2的下游分子ATF4表達(dá)的結(jié)果見(jiàn)圖7。與正常對(duì)照組比較，H/R 組ATF4蛋白表達(dá)高51.6%(P＜0.01)，提示H/R可通過(guò)激活PERK途徑導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡。過(guò)表達(dá)MR-1對(duì)ATF4蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響(P＞0.05)，卻明顯抑制H/R誘導(dǎo)的ATF4蛋白表達(dá)，表現(xiàn)為Ad-MR-1+H/R組ATF4蛋白表達(dá)較H/R組低17.7%(P＜0.01)，提示MR-1過(guò)表達(dá)通過(guò)抑制PERK途徑的激活減輕H/R誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)細(xì)胞凋亡。Mock組的ATF4蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組高19.9%(P＜0.01)，但st-MR-1組ATF4蛋白表達(dá)較mock組高42.4%(P＜0.01);敲低MR-1可加重H/R誘導(dǎo)的ATF4蛋白表達(dá)，表現(xiàn)為st-MR-1 +H/R組較H/R組高27.4%(P＜0.05)，提示敲低MR-1本身可以激活PERK途徑誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)細(xì)胞凋亡，并通過(guò)進(jìn)一步激活PERK途徑加重H/ R誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)細(xì)胞凋亡。

Figure 6.Myofibrillogenesis regulator 1(MR-1)reduced the nuclear translocation of Nrf2 in H/R-treated cardiomyocytes.A:Nrf2 immunofluorescence assay and DAPI staining under laser scanning confocal microscope (×600);B，C:the levels of nuclear Nrf2 protein and cytoplasmic Nrf2 protein examined by Western blotting.GAPDH was used as a normalization control.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs H/R;＆P＜0.05 vs mock.圖6 MR-1對(duì)H/R心肌細(xì)胞Nrf2蛋白核轉(zhuǎn)位的影響

Figure 7.Effect of myofibrillogenesis regulator 1(MR-1)on the expression of ATF4 in H/R-treated cardiomyocytes.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs H/R;＆P＜0.05 vs mock.圖7 MR-1對(duì)H/R心肌細(xì)胞ATF4蛋白表達(dá)的影響

3.4 Nrf2胞核組分蛋白與ATF4蛋白表達(dá)的相關(guān)分析相關(guān)分析顯示，Nrf2胞核組分蛋白與ATF4蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.935，P＜0.01)。

討論

I/R損傷指缺血一定時(shí)間的心肌恢復(fù)灌流后，組織損傷反而進(jìn)行性加重，心肌細(xì)胞從可逆損傷轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢赡鎿p傷的現(xiàn)象。心肌細(xì)胞凋亡和壞死是心肌再灌注損傷的特征之一［14］。減輕心肌細(xì)胞凋亡是減輕心肌細(xì)胞I/R損傷的關(guān)鍵途徑。心肌細(xì)胞H/R可在一定程度上模擬心肌缺血再灌注損傷，研究證實(shí)H/R可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡［8-9］。MR-1是一種從人類骨骼肌cDNA文庫(kù)克隆出的新功能基因，在心肌、骨骼肌、腎臟和肝臟中高表達(dá)［2-4］。本研究首次證實(shí)了MR-1通過(guò)減輕PERK磷酸化降低H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，對(duì)H/R的心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用。

前期工作證實(shí)，過(guò)表達(dá)MR-1明顯減輕H/R誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡，提示MR-1可能具有抗細(xì)胞凋亡的作用。本研究在新生SD乳鼠心肌細(xì)胞H/ R模型上，采用Annexin V/PI雙染結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)的方法，證實(shí)了H/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)為H/ R組細(xì)胞凋亡率較正常對(duì)照組高，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［15］。MR-1在心肌細(xì)胞中有生理性表達(dá)［2-4］，定位于心肌細(xì)胞漿的肌原纖維，H/R時(shí)心肌細(xì)胞MR-1表達(dá)下調(diào)。本研究證實(shí)MR-1減輕H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。我們以缺氧8 h/復(fù)氧16 h處理心肌細(xì)胞模擬在體的心肌I/R損傷，發(fā)現(xiàn)H/R誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞凋亡。我們以含有MR-1全長(zhǎng)的重組腺病毒感染心肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)MR-1對(duì)細(xì)胞凋亡率較正常對(duì)照組無(wú)明顯改變，但MR-1過(guò)表達(dá)明顯抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。相反，以st-RNA轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞以抑制MR-1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)敲低MR-1可引起心肌細(xì)胞凋亡率的升高，且敲低MR-1加重H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡率。

H/R所致的心肌細(xì)胞凋亡機(jī)制尚未完全闡明。近年來(lái)，ERS相關(guān)細(xì)胞凋亡在心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)病機(jī)制中的作用越來(lái)越受到重視。ERS是細(xì)胞對(duì)內(nèi)外刺激的適應(yīng)性反應(yīng)。適度ERS誘導(dǎo)GRP78等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶分子表達(dá)上調(diào)，有利于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處理未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白，并促進(jìn)鈣穩(wěn)態(tài)的恢復(fù);持續(xù)而嚴(yán)重的ERS可明顯上調(diào)GRP78的表達(dá)，誘導(dǎo)ERS相關(guān)的促凋亡因子CHOP的表達(dá)及活化，觸發(fā)ERS相關(guān)凋亡途徑［6］。CHOP是過(guò)度ERS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵分子，可直接下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，導(dǎo)致Bax從胞漿轉(zhuǎn)位至線粒體，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［16］。Bax和Bcl-2通過(guò)形成同源或異源二聚體來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。Bax形成同源二聚體時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，Bax與Bcl-2形成異源二聚體時(shí)抑制細(xì)胞凋亡［17］。Bcl-2與Bax蛋白量的比率決定異二聚體(Bcl-2/Bax)與同二聚體(Bax/ Bax)的比值，故細(xì)胞凋亡的發(fā)生取決于Bcl-2和Bax的相對(duì)濃度，即Bcl-2/Bax值［18］。在正常培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中，GRP78、CHOP、Bcl-2和Bax均有生理性表達(dá)，我們以H/R處理心肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)H/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞產(chǎn)生ERS相關(guān)的細(xì)胞凋亡，GRP78、CHOP和Bax表達(dá)均高于正常對(duì)照組，Bcl-2表達(dá)和Bcl-2/Bax值則均低于正常對(duì)照組。過(guò)表達(dá)MR-1可引起適度ERS，但沒(méi)有引起ERS相關(guān)細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)為GRP78表達(dá)較正常對(duì)照組高，但對(duì)細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)分子的表達(dá)無(wú)明顯影響;過(guò)表達(dá)MR-1明顯減輕H/R誘導(dǎo)的ERS相關(guān)心肌細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)為較H/R組GRP78、CHOP和Bax蛋白表達(dá)更低，Bcl-2蛋白表達(dá)更高，Bcl-2/Bax值更高;敲低MR-1可產(chǎn)生ERS相關(guān)心肌細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)為較mock組GRP78和CHOP蛋白表達(dá)高，Bcl-2/Bax值低;且MR-1敲低后H/R較單純H/R誘導(dǎo)的ERS相關(guān)細(xì)胞凋亡更為嚴(yán)重，表現(xiàn)為較H/R組GRP78、CHOP和Bax蛋白表達(dá)更高，Bcl-2蛋白表達(dá)更低，Bcl-2/Bax比值更低。上述結(jié)果提示，MR-1可能作為一個(gè)重要的內(nèi)源性保護(hù)分子，在減輕H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞ERS相關(guān)凋亡中發(fā)揮重要作用。

PERK是介導(dǎo)ERS相關(guān)細(xì)胞凋亡的重要感受分子。生理狀態(tài)下，PERK與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)分子GRP78結(jié)合，以無(wú)活性復(fù)合物的形式存在［19］。未折疊蛋白增多時(shí)，GRP78與未折疊蛋白結(jié)合而與PERK解離。解離后的PERK發(fā)生自身磷酸化而被激活，進(jìn)一步磷酸化其下游底物eIF2α，選擇性上調(diào)ATF4。長(zhǎng)期過(guò)度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，ATF4上調(diào)CHOP的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致ERS相關(guān)細(xì)胞凋亡［20］。我們前期研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，H/R誘導(dǎo)的PERK磷酸化水平、PERK下游信號(hào)分子ATF4和CHOP的表達(dá)更高，提示H/R誘導(dǎo)PERK介導(dǎo)的ERS相關(guān)細(xì)胞凋亡［8-9］。Nrf2生理狀態(tài)時(shí)位于細(xì)胞漿內(nèi)的細(xì)胞骨架，與其抑制蛋白Keap1結(jié)合，處于非游離、非活性狀態(tài)。當(dāng)I/ R誘導(dǎo)Nrf2發(fā)生核轉(zhuǎn)位，作用于AREs的相關(guān)序列，激活相關(guān)靶基因，繼而啟動(dòng)下游抗氧化蛋白及酶類的基因轉(zhuǎn)錄，提高細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力［10］。近期研究證實(shí)Nrf2是位于PERK下游的重要轉(zhuǎn)錄因子，PERK磷酸化激活Nrf2發(fā)生核轉(zhuǎn)位［6］，Nrf2的胞核組分蛋白可能作用于ATF4啟動(dòng)子，上調(diào)ATF4的轉(zhuǎn)錄水平［11］，并進(jìn)一步上調(diào)CHOP的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致ERS相關(guān)細(xì)胞凋亡［20］。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，將人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞敲低Nrf2后行缺氧處理，ATF4的表達(dá)較缺氧組明顯降低。染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)果顯示Nrf2作用于ATF4啟動(dòng)子，且過(guò)表達(dá)Nrf2激活A(yù)TF4啟動(dòng)子，促進(jìn)ATF4的轉(zhuǎn)錄［11］。此外，敲低內(nèi)皮細(xì)胞的Nrf2后行氧化磷脂處理，亦可顯著降低ATF4表達(dá)［21］。根據(jù)文獻(xiàn)推斷，細(xì)胞凋亡可通過(guò)內(nèi)外因素激活PERK/Nrf2核轉(zhuǎn)位/ATF4/CHOP途徑發(fā)生。

本研究證實(shí)，在正常培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中，Nrf2存在于胞核和胞漿內(nèi)，但以胞漿內(nèi)分布為主，PERK、ATF4和CHOP均有生理性表達(dá)。我們以H/R處理心肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)H/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞PERK磷酸化，引起Nrf2核轉(zhuǎn)位，上調(diào)ATF4的表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)CHOP的表達(dá)。同時(shí)，雖然過(guò)表達(dá)MR-1對(duì)PERK途徑無(wú)明顯影響，表現(xiàn)為PERK磷酸化及下游信號(hào)分子的蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化，但是過(guò)表達(dá)MR-1后行H/R處理，可下調(diào)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞PERK磷酸化，減少Nrf2核轉(zhuǎn)位，下調(diào)ATF4和CHOP的蛋白表達(dá)，提示過(guò)表達(dá)MR-1可通過(guò)減輕H/R對(duì)PERK途徑的激活，減輕H/R誘導(dǎo)的ERS相關(guān)細(xì)胞凋亡。此外，敲低MR-1可誘導(dǎo)PERK磷酸化介導(dǎo)的ERS相關(guān)細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)為PERK磷酸化高于MOCK組，Nrf2核轉(zhuǎn)位較mock組更明顯，ATF4和CHOP蛋白表達(dá)較mock組高;敲低MR-1后行H/R處理可通過(guò)進(jìn)一步激活H/R誘導(dǎo)的PERK途徑，進(jìn)而加重H/R誘導(dǎo)的ERS相關(guān)細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)為PERK磷酸化較H/R組高，Nrf2核轉(zhuǎn)位較H/R組更明顯，ATF4和CHOP蛋白表達(dá)較H/R組高。在此基礎(chǔ)上對(duì)ATF4蛋白表達(dá)和胞核Nrf2蛋白之間進(jìn)行相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，ATF4蛋白表達(dá)與Nrf2胞核組分蛋白呈正相關(guān)，提示Nrf2核轉(zhuǎn)位介導(dǎo)的凋亡信號(hào)途徑可能通過(guò)促進(jìn)ATF4蛋白表達(dá)引起細(xì)胞凋亡。

另有文獻(xiàn)報(bào)道，轉(zhuǎn)錄因子Nrf2和ATF4具有相似的靶基因，存在協(xié)同和拮抗作用。兩者可直接誘導(dǎo)AREs相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄［22］，但也可直接作用于CHOP啟動(dòng)子，ATF4促進(jìn)CHOP轉(zhuǎn)錄，Nrf2抑制CHOP轉(zhuǎn)錄［23］。此外，Nrf2也可通過(guò)解除ATF4與CHOP的結(jié)合，進(jìn)而抑制CHOP轉(zhuǎn)錄［24］。根據(jù)研究結(jié)果推斷，我們認(rèn)為在H/R引起心肌細(xì)胞PERK介導(dǎo)的ERS相關(guān)細(xì)胞凋亡的過(guò)程中，Nrf2發(fā)生核轉(zhuǎn)位，促進(jìn)ATF4的表達(dá)。雖然Nrf2可直接或間接下調(diào)CHOP的轉(zhuǎn)錄，但是ATF4上調(diào)促進(jìn)CHOP的表達(dá)增加起主要作用。這提示H/R通過(guò)PERK介導(dǎo)的Nrf2核轉(zhuǎn)位/ATF4/CHOP途徑誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，而MR-1通過(guò)抑制上述途徑減輕H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，我們認(rèn)為MR-1通過(guò)抑制過(guò)度ERS發(fā)揮減輕心肌H/R損傷的作用，表現(xiàn)為降低H/R誘導(dǎo)的GRP78蛋白表達(dá)，抑制PERK介導(dǎo)的Nrf2核轉(zhuǎn)位/ATF4/CHOP途徑，減輕H/R誘導(dǎo)的ERS相關(guān)細(xì)胞凋亡。但MR-1對(duì)在體大鼠心肌I/R損傷的心肌保護(hù)作用尚待進(jìn)一步研究。

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Myofibrillogenesis regulator 1 attenuates hypoxia/reoxygenation-induced apoptosis of cardiomyocytes by inhibiting PERK/Nrf2 pathway

TAO Tian-qi，WANG Xiao-reng，XU Fei-fei，LIU Mi，LI Yu-zhen，LIU Xiu-hua
(Department of Pathophysiology，Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853，China.E-mail:xiuhualiu98@163.com)

AIM:To investigate the effect of myofibrillogenesis regulator 1(MR-1)on hypoxia/reoxygenation (H/R)-induced apoptosis of cardiomyocytes and to study the role of protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase (PERK)/nuclear factor E2-related factor 2(Nrf2)pathway.METHODS:In the H/R model of primarily cultured neonatal rat cardiomyocytes，the apoptosis was assessed by Annexin V/PI double staining.Western blotting was used to detect the protein levels of glucose-regulated protein 78(GRP78)，phosphorylated PERK，Nrf2，activating transcription factor 4 (ATF4)，C/EBP homologous protein(CHOP)，Bcl-2 and Bax.The effects of over-expression or knockdown of MR-1 on the apoptosis and the PERK/Nrf2 pathway were determined.RESULTS:H/R induced the apoptosis of cardiomyocytes.Compared with H/R group，MR-1 over-expression attenuated H/R-induced apoptosis(P＜0.01)，down-regulated CHOP expression(P＜0.05)，and increased Bcl-2/Bax ratio(P＜0.01).MR-1 over-expression suppressed H/R-induced PERK phosphorylation，Nrf2 nuclear translocation and ATF4 expression(P＜0.01).However，MR-1 knockdown aggravated H/R-induced apoptosis(P＜0.01)，up-regulated CHOP expression(P＜0.05)，and decreased Bcl-2/Bax ratio(P＜0.01).MR-1 knockdown up-regulated H/R-induced PERK phosphorylation(P＜0.05)，Nrf2 nuclear translocation and ATF4 expression(P＜0.01).CONCLUSION:MR-1 suppresses H/R-induced cardiomyocyte apoptosis by inhibiting PERK/Nrf2 pathway.

Apoptosis;Hypoxia/reoxygenation;Cardiomyocytes;Myofibrillogenesis regulator 1;Protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase;Nuclear factor E2-related factor 2

R363.1

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.02.001

1000-4718(2014)02-0193-10

2013-10-15

2014-01-02

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81170140;No.81070130)

△通訊作者Tel:010-66939763;E-mail:xiuhualiu98@163.com