補中益氣湯含藥血清對人肺腺癌A549/DDP細(xì)胞耐藥作用的影響*

劉亞莉， 王 瑩， 易佳麗， 史妍婷， 劉春英△

肺癌是嚴(yán)重威脅人類健康與生命的惡性腫瘤，病人診斷時多處于中晚期，是我國惡性腫瘤致死的首要因素。化療是治療肺癌的常用手段，但肺癌對化療藥物產(chǎn)生耐藥是影響療效的重要因素。順鉑是肺癌常用的化療藥物，其抗腫瘤的毒性和有效性已經(jīng)得到肯定。但順鉑毒副反應(yīng)重且易于形成耐藥，這嚴(yán)重影響了肺癌的臨床療效，限制了順鉑的應(yīng)用［1-2］。盡管目前采用多種藥物聯(lián)合配伍、加大藥物劑量等策略應(yīng)對腫瘤耐藥的發(fā)生，但藥物的毒副作用也隨之增加，加重患者機體功能的衰竭。因此，尋找有效的能夠逆轉(zhuǎn)其耐藥的藥物成為抗腫瘤治療的一個重要輔助手段。本實驗運用補中益氣湯含藥血清作用于人肺腺癌細(xì)胞株A549和A549/DDP，觀察其對耐藥細(xì)胞株A549/DDP增殖的抑制作用及探討其可能的作用機制。

材料和方法

1 主要試劑

DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清和0.25%胰蛋白酶購自HyClone;四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)試劑盒購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司;順鉑購自齊魯制藥廠;磷脂酰肌醇3－激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)和蛋白激酶 B(protein kinase B，Akt)抗體購于南京凱基生物技術(shù)有限公司。Trizol Reagent購于Invitrogen Life Technologies;PI3K和Akt熒光定量PCR試劑盒購于寶生物工程(大連)有限公司;引物合成由北京華大基因公司完成。

2 制備含藥血清

補中益氣湯由中藥黃芪、炙甘草、人參、當(dāng)歸、陳皮、升麻、柴胡和白術(shù)組成，全部藥材均購于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥房，并經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥理實驗室鑒定。根據(jù)《藥理實驗方法學(xué)》［3］“動物與人體的每千克體重劑量折算系數(shù)表”，設(shè)立補中益氣湯高、中、低劑量組分別為成人推薦日用量的2、1和1/2倍，常規(guī)煎煮，過濾、水浴蒸發(fā)至每毫升含生藥2.626 g、1.313 g和0.657 g。冷卻后4 ℃保存。SD大鼠由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動物部提供，動物許可證號為遼實動(字)(2012-0012號)，清潔級，體重(200±10)g，雌雄不限，40只，隨機分為補中益氣湯高劑量組、補中益氣湯中劑量組、補中益氣湯低劑量組和對照組，給予高、中、低劑量的補中益氣湯13.13 g/kg、6.57 g/kg、3.29 g/kg及等量生理鹽水灌胃，每天1次，連續(xù)3 d，末次給藥1 h腹主動脈采血，2 000 r/min離心 5 min，取上清，56 ℃水浴30 min 滅活，0.22 μm 微孔濾膜過濾，－20℃保存。

3 方法

3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肺腺癌細(xì)胞株A549和A549/DDP由中國醫(yī)科院腫瘤研究中心細(xì)胞庫提供。置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換液1次，0.25%胰蛋白酶消化，4～6 d傳代1次。

3.2 A549細(xì)胞和A549/DDP細(xì)胞的生長曲線測定用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基200 μL培養(yǎng)A549細(xì)胞和A549/DDP細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后分別于12 h、24 h、48 h和72 h收集細(xì)胞進(jìn)行MTT比色法檢測。以時間為橫軸、每一時點的吸光度(absorbance，A)為縱軸繪制細(xì)胞生長曲線。

3.3 最佳含藥血清篩選 取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞和A549/DDP細(xì)胞，調(diào)整密度為1×105/L，分為:(1)正常對照組，用含10%對照組大鼠血清的DMEM 200 μL培養(yǎng);(2)含藥血清高劑量組;(3)含藥血清中劑量組;(4)含藥血清低劑量組。(2)～(4)組分別加含10%高、中、低劑量大鼠含藥血清的DMEM培養(yǎng)液200 μL，每組設(shè)5個復(fù)孔，同時設(shè)不加細(xì)胞的調(diào)零孔，各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)12 h、24 h、48 h和72 h后，加5 g/L MTT 20 μL，37 ℃培養(yǎng) 4 h 吸棄上清液，每孔加入二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)150 μL，振蕩10 min，用酶標(biāo)儀在波長570 nm 測定各孔的A值，重復(fù)3次取平均值。細(xì)胞生長抑制率(%)=(實驗組平均A值－空白組平均A值)/(對照組平均A值－空白組平均A值)×100%。

3.4 最佳含藥血清對A549細(xì)胞和A549/DDP細(xì)胞耐藥逆轉(zhuǎn)作用的測定 取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞和A549/DDP細(xì)胞，調(diào)整密度為1×105/L，分為順鉑+對照血清組和順鉑+最佳含藥血清組，每組順鉑設(shè)7個濃度。待細(xì)胞貼壁后，順鉑+對照血清組加入含10 μL順鉑和含10%大鼠對照血清的DMEM培養(yǎng)液 200 μL，順鉑設(shè)有 6 μmol/L、12 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L 和 400 μmol/L的濃度梯度;順鉑+最佳含藥血清組加入含10 μL順鉑和含10%最佳含藥血清的DMEM培養(yǎng)液200 μL，順鉑的濃度梯度同上。每組設(shè)5個復(fù)孔，保證各組加入的血清總量相同，同時設(shè)不加細(xì)胞的調(diào)零孔，置于5%CO2、37℃孵育培養(yǎng)48 h，每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μL，培養(yǎng)4 h后，棄上清液，每孔加DMSO 150 μL，搖床混勻10 min，用酶標(biāo)儀在波長570 nm處測各孔A值。上述實驗重復(fù)3次取平均值。計算細(xì)胞生長抑制率(方法同上)，采用直線回歸方法計算藥物的半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50);耐藥指數(shù)(resistance index，RI)=耐藥細(xì)胞株IC50/敏感細(xì)胞株IC50，逆轉(zhuǎn)指數(shù)(reversal index，RI)=藥物IC50(不加逆轉(zhuǎn)劑)/藥物IC50(加逆轉(zhuǎn)劑)。

3.5 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測A549細(xì)胞和A549/DDP細(xì)胞中PI3K和Akt蛋白的表達(dá) 將A549細(xì)胞和A549/DDP細(xì)胞接種于預(yù)先置有蓋玻片的12孔板中，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，2種細(xì)胞株各分為對照血清組、最佳含藥血清組、LY294002組、LY294002+最佳含藥血清組(聯(lián)合組)和陰性對照組。對照血清組和陰性對照組加含有10%SD大鼠對照血清的DMEM培養(yǎng)基200 μL;最佳含藥血清組加入含有10%最佳含藥血清的DMEM培養(yǎng)基200 μL;LY294002組在對照血清組的基礎(chǔ)上加LY294002 1 μL;聯(lián)合組在最佳含藥血清組的基礎(chǔ)上加LY294002 1 μL。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，取出蓋玻片，4%多聚甲醛固定，3%H2O2孵育20 min，10%山羊血清封閉30 min，Ⅰ抗孵育，陰性對照組以PBS代替Ⅰ抗，4℃過夜，加Ⅱ抗作用30 min，二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，封片。采用Image-Pro Plus醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，在400倍高倍鏡下，隨機取5個視野，每個視野為2 592×1 944像素點，分別測出陽性反應(yīng)細(xì)胞的總面積和積分吸光度(integral absorbance，IA)，每組設(shè)3個平行孔，實驗重復(fù)3遍。

3.6 Western blotting檢測 PI3K和Akt蛋白水平

取對數(shù)生長期的A549/DDP細(xì)胞，分組及培養(yǎng)條件同3.5。培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，提取總蛋白，離心取上清，BCA試劑盒測定蛋白濃度，與5×SDS上樣緩沖液100℃煮沸5 min，以每孔60 μg上樣至10%SDS-PAGE凝膠中，電泳分離(120 V)，轉(zhuǎn)印(50 V、2 h)，TBS浸泡10 min，含5%脫脂奶粉的TBS 37℃封閉1 h。TBS洗膜5 min×2，Ⅰ抗4℃孵育過夜，TTBS洗膜5 min×2，Ⅱ抗37℃孵育2 h，TTBS洗膜5 min×2，TBS洗膜5 min。在暗室用ECL發(fā)光，圖像掃描并分析結(jié)果。采用所測的PI3K和Akt條帶與內(nèi)參GAPDH條帶的吸光度比值表示PI3K和Akt蛋白的表達(dá)水平。

3.7 Real-time PCR檢測A549/DDP細(xì)胞中PI3K和Akt中mRNA的表達(dá) 取對數(shù)生長期的A549/DDP細(xì)胞，分組同3.5。給予相應(yīng)的干預(yù)因素繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集各組細(xì)胞。采用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，檢驗樣本RNA純度，計算RNA濃度(g/L)=A260×40×稀釋倍數(shù)/1 000。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)條件為37℃ 15 min，85℃ 5 s，1個循環(huán)。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為95℃ 0.5 min;95℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環(huán);95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95℃ 15 s。反應(yīng)體系為20 μL，每個實驗重復(fù)3次，取平均值。PCR引物采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計如下:GAPDH 5’-CAATGACCCCTTCATTGACC-3’，5’-TGGAAGATGGTGATGGGATT-3’，產(chǎn) 物 135 bp;PI3K 5’-CCGAGACACTGCTGATG-3’，5’-GGTATTTGGACACTGGGTA-3’，產(chǎn)物254 bp;Akt 5’-CTCATTCCAGACCCACGAC-3’， 5’-CAGCCCGAAGTCCGTTA-3’，產(chǎn)物241 bp。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，各組間數(shù)據(jù)的比較用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組間兩兩比較采用LSD法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 A549細(xì)胞和A549/DDP細(xì)胞生長曲線的測定

MTT結(jié)果顯示，2種細(xì)胞在培養(yǎng)12 h、24 h和48 h時A值逐漸增加，在48 h達(dá)高峰;而在72 h時，2種細(xì)胞的A值大幅下降，提示在72 h細(xì)胞的生長能力已經(jīng)降低，死亡細(xì)胞增多，見圖1。

Figure 1.Growth curves of A549 cells and A549/DDP cells.Mean±SD.n=5.圖1 A549細(xì)胞和A549/DDP細(xì)胞的生長曲線

2 最佳含藥血清的篩選結(jié)果

不同劑量補中益氣湯含藥血清對A549細(xì)胞和A549/DDP細(xì)胞生長的抑制率見表1。結(jié)果表明，A549細(xì)胞和A549/DDP細(xì)胞分別在含藥血清高、中、低劑量作用下，隨著作用時間的的增加，其生長抑制率逐漸增加，至48 h達(dá)到高峰，具有時間－劑量效應(yīng)。在作用至72 h時的抑制率較48 h時降低，這與72 h時細(xì)胞的增殖能力已經(jīng)下降、死亡細(xì)胞較多有關(guān)。中劑量含藥血清對A549/DDP細(xì)胞作用48 h時的抑制率為9.14%，與高劑量含藥血清作用24 h和48 h的抑制率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。但根據(jù)文獻(xiàn)［4-5］，抑制率小于10%時，對敏感株和耐藥株細(xì)胞均無明顯細(xì)胞毒作用。要采用無細(xì)胞毒性劑量作為逆轉(zhuǎn)劑量，因此選擇10%的中劑量含藥血清作用48 h為最佳含藥血清和最佳作用時間。

表1 含藥血清對A549細(xì)胞和A549/DDP細(xì)胞的生長抑制率Table 1.The inhibitory rate of medicated serum for A549 cells and A549/DDP cells(%.Mean±SD.n=5)

3 最佳含藥血清對A549/DDP細(xì)胞耐藥逆轉(zhuǎn)的測定

順鉑對 A549細(xì)胞的 IC50為(28.62±0.12)μmol/L，對 A549/DDP 細(xì)胞的 IC50則為(210.57 ±1.02)μmol/L，A549/DDP細(xì)胞對順鉑的耐藥指數(shù)為7.35;順鉑和最佳含藥血清聯(lián)合作用對A549細(xì)胞的IC50為(22.73 ±0.31)μmol/L，對 A549/DDP 細(xì)胞的IC50為(85.52 ±0.17)μmol/L，A549/DDP 細(xì)胞對順鉑和最佳含藥血清聯(lián)合作用的耐藥指數(shù)為3.76，提示最佳含藥血清可協(xié)同順鉑抑制A549/DDP細(xì)胞的生長，降低A549/DDP細(xì)胞對順鉑的耐藥性。最佳含藥血清與順鉑聯(lián)合作用時，A549/DDP細(xì)胞對各劑量順鉑的敏感性明顯增強，逆轉(zhuǎn)指數(shù)約為2.46。

4 免疫組化法檢測最佳含藥血清對A549/DDP細(xì)胞PI3K和Akt蛋白的表達(dá)

PI3K和Akt蛋白在A549/DDP細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿中均有表達(dá)，對照血清組和LY294002組可見較多棕黃色顆粒，最佳含藥血清組和聯(lián)合組的棕黃色顆粒較之減少，陰性對照組則看不到棕黃色顆粒，見圖2、3。與對照血清組比較，最佳含藥血清組和聯(lián)合組PI3K和Akt的表達(dá)明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);LY294002組與對照血清組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見圖4。

Figure 2.Expression of PI3K in A549/DDP cells(immunocytochemical method，×200).A:control serum group;B:optimal medicated serum group;C:LY294002 group;D:LY294002+optimal medicated serum group;E:negative group.圖2 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測A549/DDP細(xì)胞PI3K的表達(dá)

Figure 3.Expression of Akt in A549/DDP cells(immunocytochemical method，×200).A:control serum group;B:optimal medicated serum group;C:LY294002 group;D:LY294002+optimal medicated serum group;E:negative group.圖3 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測A549/DDP細(xì)胞Akt的表達(dá)

5 Western blotting檢測最佳含藥血清對A549/DDP細(xì)胞中PI3K和Akt蛋白表達(dá)的影響

對照血清組與LY294002組比較，A549/DDP細(xì)胞的PI3K表達(dá)差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，而最佳含藥血清組和聯(lián)合組的表達(dá)明顯減少，與對照血清組比較均差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);Akt蛋白的表達(dá)在最佳含藥血清組和聯(lián)合組減少，與對照血清組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而LY294002組與對照血清組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)，見圖5。

Figure 4.The protein expression of PI3K and Akt in A549/DDP cells with different treatments.Mean ± SD.n=5.*P ＜0.05 vs control serum group.圖4 免疫組化方法檢測不同處理的A549/DDP細(xì)胞PI3K、Akt蛋白的表達(dá)

Figure 5.Expression of PI3K and Akt in A549/DDP cells detected by Western blotting.1:combination group;2:LY294002 group;3:optimal medicated serum group;4:control serum group.Mean ± SD.n=5.#P ＜ 0.05 vs 2 or 4.圖5 Western blotting檢測不同干預(yù)的A549/DDP細(xì)胞PI3K和Akt蛋白的表達(dá)

6 RT-PCR檢測最佳含藥血清對A549/DDP細(xì)胞PI3K和Akt mRNA表達(dá)的影響

最佳含藥血清組與聯(lián)合組的PI3K mRNA的表達(dá)水平與對照血清組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);LY294002組PI3K mRNA的表達(dá)水平與正常動物血清組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);Akt mRNA表達(dá)在最佳含藥血清組和聯(lián)合組均減少，與對照血清組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，與正常動物血清組比較，差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

表2 各組A549/DDP細(xì)胞中PI3K和Akt mRNA表達(dá)水平比較Table 2.The mRNA expression levels of PI3K and Akt in the A549/DDP cells with different treatments(Mean±SD.n=5)

討 論

補中益氣湯由金元時期著名醫(yī)家李東垣所創(chuàng)，由黃芪、炙甘草、人參、當(dāng)歸、陳皮、升麻、柴胡和白術(shù)八味中藥組成，臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)其可改善肺癌患者氣短、咳嗽、咳血等癥狀，提高患者生存質(zhì)量。既往藥理研究表明方中含有的皂甙類、多糖類、黃酮類、生物堿、氨基酸及揮發(fā)油等，對多種腫瘤有不同程度的抑制作用，此外還有抗突變、調(diào)節(jié)免疫功能、耐缺氧、抑菌消炎等綜合作用［3］。但補中益氣湯對肺癌細(xì)胞抑制的作用機制以及通過何種途徑改善順鉑的耐藥作用卻鮮有報道，本研究通過血清藥理學(xué)的方法探討補中益氣湯對肺腺癌耐順鉑細(xì)胞株A549/DDP的逆轉(zhuǎn)作用及其與順鉑聯(lián)合作用時對PI3K/Akt信號通路的的干預(yù)作用。

血清藥理學(xué)是中藥藥理體外研究較為科學(xué)的方法，本實驗用不同劑量的補中益氣湯灌服大鼠，在血藥濃度達(dá)到穩(wěn)定后取血清，以不同濃度的含藥血清作用于A549/DDP細(xì)胞，通過MTT法篩選出10%中劑量含藥血清作用48 h為最佳含藥血清及最佳作用時間。通過MTT法測得A549/DDP細(xì)胞對順鉑的耐藥指數(shù)為7.35，而對順鉑和最佳含藥血清聯(lián)合作用的耐藥指數(shù)為3.76，提示補中益氣湯可以提高A549/DDP細(xì)胞對順鉑的敏感性，補中益氣湯參與了A549/DDP細(xì)胞抗順鉑耐藥的逆轉(zhuǎn)機制。

研究表明，順鉑對肺癌療效降低的主要原因是產(chǎn)生了耐藥性［6］，PI3K/Akt通路激活后能夠抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡。研究表明，PI3K/Akt通路和肺癌順鉑耐藥有關(guān)，文獻(xiàn)報道在細(xì)胞水平上，有Akt過表達(dá)的人肺癌細(xì)胞對順鉑出現(xiàn)耐藥，在肺腺癌細(xì)胞A549中，PI3K/Akt的過表達(dá)明顯減弱A549細(xì)胞對順鉑的化療敏感性［7］;順鉑作用下人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI H460中的PI3K/Akt過表達(dá)，使抗凋亡蛋白Bcl-xL表達(dá)增加，p53通路激活延遲，導(dǎo)致肺癌細(xì)胞凋亡抑制對順鉑產(chǎn)生耐藥［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，補中益氣湯可使A549/DDP細(xì)胞中PI3K蛋白和mRNA表達(dá)減少(P＜0.05，與對照血清組比較)，提示補中益氣湯可通過抑制PI3K mRNA的表達(dá)而減少蛋白的表達(dá)量，其是在基因水平發(fā)揮逆轉(zhuǎn)A549/DDP的耐順鉑作用。據(jù)文獻(xiàn)［9］報道，在順鉑耐藥人的肺癌細(xì)胞株中，抑制PI3K/Akt的表達(dá)會表現(xiàn)為對順鉑的敏感性增加，因此推斷補中益氣湯是通過增加肺癌耐藥細(xì)胞A549/DDP對順鉑的敏感性而實現(xiàn)逆轉(zhuǎn)作用的;LY294002是PI3K/Akt通路中廣泛應(yīng)用的PI3K抑制劑，能特異性地抑制PI3K p110亞單位的催化活性，使磷酸化Akt的表達(dá)下降，明顯抑制生長和誘導(dǎo)凋亡，且其抑制作用呈劑量依賴性［10］。本研究應(yīng)用LY294002后，LY294002組 PI3K、Akt蛋白和 mRNA的表達(dá)與對照血清組比較差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，而聯(lián)合組的PI3K、Akt蛋白和mRNA的表達(dá)與對照血清組比較明顯降低(P＜0.05)，提示LY294002抑制PI3K p110亞單位的催化活性是在蛋白水平上進(jìn)行的，不影響PI3K mRNA的表達(dá)，也不影響總Akt蛋白和mRNA的表達(dá);最佳含藥血清可減少PI3K、Akt mRNA和蛋白的表達(dá)。Akt是PI3K/Akt通路中該信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性中心，它能通過磷酸化下游的多種底物如caspase-9、Bad、survivin等促進(jìn)細(xì)胞凋亡［11-12］。究竟補中益氣湯是對PI3K的抑制導(dǎo)致Akt表達(dá)的減少還是藥物也同時作用于Akt的位點以及對下游因子是否有作用，都有賴于進(jìn)一步的研究。

綜上所述，本研究表明補中益氣湯干預(yù)A549/DDP細(xì)胞耐順鉑作用是通過PI3K/Akt信號通路實現(xiàn)的，補中益氣湯通過減少 PI3K的表達(dá)而降低A549/DDP細(xì)胞的耐藥指數(shù)，增加A549/DDP細(xì)胞對順鉑的敏感性，干預(yù)或調(diào)整著A549/DDP細(xì)胞的耐藥性。

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