經(jīng)皮三叉神經(jīng)電刺激減輕戊四氮誘導(dǎo)的大鼠癲癇發(fā)作并抑制海馬內(nèi)IL-1β和TNF-α的表達*

劉益民， 王倩倩， 賀慧艷， 王 玉△

近年的研究表明，三叉神經(jīng)電刺激有明確的抗癲癇作用，其具體機制尚未見明確的研究報道［1-2］。我們的前期實驗研究表明，經(jīng)皮三叉神經(jīng)電刺激(external trigeminal nerve electrostimulation，eTNS)預(yù)處理增加了戊四氮(pentylenetetrazole，PTZ)致癇大鼠海馬區(qū)谷氨酸脫羧酶的表達，進而可能通過誘導(dǎo)腦內(nèi)抑制性機制的增強來實現(xiàn)抗癲癇作用［3］。諸多因素參與癲癇發(fā)生、發(fā)展過程［4-6］，越來越多的實驗和臨床研究表明炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)是癲癇的的重要病理機制［7-8］。有鑒于此，我們對大鼠進行經(jīng)皮三叉神經(jīng)電刺激，之后應(yīng)用PTZ點燃癲癇大鼠，觀察預(yù)處理對癲癇是否具有抑制作用以及對海馬致癇細胞因子的影響，為經(jīng)皮三叉神經(jīng)電刺激在癲癇防治中的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

材料和方法

1 動物與分組

選用成年健康雄性 SD大鼠，220～250 g，SPF級，由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。置于安靜、避光、自由攝取食水的室溫環(huán)境下飼養(yǎng)2周，以適應(yīng)環(huán)境。動物隨機分為對照組(control組)、致癇組(PTZ組)和eTNS組，eTNS組動物給予PTZ點燃癲癇及7 d、14 d和28 d連續(xù)的經(jīng)皮三叉神經(jīng)電刺激，PTZ組大鼠給予PTZ點燃癲癇及相同時間的0參數(shù)假刺激，而control組大鼠僅給予相同時間的0參數(shù)假刺激。

2 主要試劑

PTZ購自Sigma，兔抗大鼠白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)和腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor α，TNF-α)多克隆抗體購于 Abcam，ELISA 試劑盒購自Invitrogen，免疫組化II抗試劑盒購于北京博奧森生物技術(shù)公司。經(jīng)皮電刺激儀(KD-2A型，北京博洋生物器械公司)。

3 主要方法

3.1 經(jīng)皮三叉神經(jīng)電刺激 實驗操作時動作輕柔，大鼠先腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉動物。經(jīng)皮三叉神經(jīng)電刺激組:大鼠俯臥固定，將2個膜式電極對稱外置于眼眶上方約1 cm中內(nèi)1/3處的三叉神經(jīng)眼支分布區(qū)域，固定后外接經(jīng)皮電刺激儀。刺激參數(shù)［9］:頻率 140 Hz、電流 10 mA、脈寬 500 μs、正相脈沖刺激30 s，間歇5 min，每天連續(xù)刺激2 h。Control組和PTZ組大鼠亦被固定，外接刺激儀器，刺激參數(shù)均設(shè)置為0，持續(xù)2 h。各組操作均在8:00-12:00間進行。

3.2 急性癇性痙攣模型的建立 各實驗動物于7 d、14 d和28 d經(jīng)皮電刺激或假刺激結(jié)束后分別給予PTZ(75 mg/kg)腹腔注射并觀察行為學(xué)變化。依據(jù)Rudge等［10］對大鼠癲癇發(fā)作時的行為描述來判斷動物是否癇性發(fā)作并進行評分:0分:無任何反應(yīng);1分:面部痙攣，包括眨眼、動須、節(jié)律性咀嚼等;2分:1分加節(jié)律性點頭;3分:出現(xiàn)單肢痙攣;4分:出現(xiàn)雙前肢痙攣，甩尾;5分:四肢或全身痙攣大發(fā)作，摔倒;6分:癲癇持續(xù)狀態(tài)，持續(xù)30 min以上的雙前肢痙攣或全身痙攣即可認為是持續(xù)狀態(tài);7分:死亡。行為學(xué)觀察后24 h給予10%水合氯醛深度麻醉后(400 mg/kg，腹腔注射)取材，分別行免疫組化灌注固定取材及海馬組織提取兩部分。

3.3 免疫組化灌注取材及固定 大鼠麻醉滿意后，迅速開胸暴露心臟，用灌注穿刺針沿著心臟的縱軸方向經(jīng)心尖刺入左心室至升主動脈根部縫扎固定，在右心耳剪一小口，可見血液流出，先用0.9%氯化鈉注射液200 mL快速灌注以沖凈血液，待右心耳流出清亮液體時，再用4%多聚甲醛磷酸緩沖液(0.1 mmol/L PBS，pH 7.4)100 mL先快后慢灌注，灌注時間約15 min，灌注至大鼠四肢及尾巴伸直變硬時，斷頭取腦組織固定于4% 多聚甲醛中72 h，流水沖洗標(biāo)本18 h后常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，取含背側(cè)海馬最大冠狀層面的腦組織作石蠟切片，片厚4 μm。

3.4 免疫組化法染色 切片常規(guī)脫蠟至水，抗原熱修復(fù)后依次加入3%過氧化氫 、10%山羊血清封閉液，之后分別加Ⅰ抗 IL-1β(1∶100)或 TNF-α(1∶200)，于4℃冰箱過夜孵育，滴加II抗工作液及辣根酶，DAB顯色清晰后沖洗，烤干后中性樹膠封片，陰性對照用PBS代替Ⅰ抗。

3.5 ELISA海馬組織提取及組織處理 各實驗動物于癲癇持續(xù)狀態(tài)后24 h，腹腔注射10%水合氯醛(400 mg/kg)深度麻醉后斷頭取腦，冰盤內(nèi)沿矢狀線直切成對半，兩側(cè)大腦半球的海馬組織被離斷，存于液氮罐中。

3.6 細胞因子ELISA定量測定 取出液氮罐中留置海馬組織，標(biāo)本保持低溫條件下，各標(biāo)本稱重后用固定倍數(shù)的生理鹽水稀釋，快速電動勻漿后移入離心管，4℃低溫離心20 min(3 000 r/min)。離心后取上清，分裝后1份待測，其余－80℃冰箱保存待用。ELISA法檢測各標(biāo)本內(nèi)IL-1β和TNF-α的含量，具體方法按說明書進行。

3.7 免疫組化圖像采集 圖像采集在Olympus顯微攝像系統(tǒng)觀察陽性細胞的表達，切片置光學(xué)顯微鏡下，分別對每張切片的海馬各區(qū)進行詳細觀察及攝片。同一指標(biāo)采用相同的曝光度，并以計算機提供的窗口為單位(×400)，利用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)(Media Cybernetics)，隨機測定窗口區(qū)陽性細胞的平均光密度值。系統(tǒng)自動把測定區(qū)轉(zhuǎn)換為純白背景，陽性細胞轉(zhuǎn)換為灰色，在系統(tǒng)進行各指標(biāo)平均吸光測定時，參數(shù)保持不變。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件處理。行為學(xué)分析時，組間癲癇持續(xù)時間的比較運用t檢驗，發(fā)作強度比較運用曼-惠特尼U檢驗。海馬細胞因子的定量比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)及 SNK-q檢驗，以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 三叉神經(jīng)電刺激減輕PTZ點燃大鼠的發(fā)作程度

Control組大鼠表現(xiàn)正常，無癲癇發(fā)作癥狀。PTZ組和eTNS組動物在腹腔注入PTZ后2～5 min內(nèi)均出現(xiàn)癲癇大發(fā)作癥狀，如全身肌肉陣發(fā)性抽搐、強直性抽搐、尖叫、跳躍、甩尾等。15 min左右癥狀逐漸減輕，隨時間延長，抽搐幅度逐漸減小，持續(xù)約1～2 h完全緩解。三叉神經(jīng)刺激后28 d的動物癇性發(fā)作等級和發(fā)作時間較PTZ組明顯降低(P＜0.05)，見表1。

表1 急性驚厥大鼠的發(fā)作強度及持續(xù)時間Table 1.Severity and duration of acute seizure in rats(Mean±SD)

2 免疫組化半定量分析

Control組大鼠各時點IL-1β和TNF-α未見明顯陽性細胞的表達。從形態(tài)學(xué)觀察，IL-1β在膠質(zhì)細胞和少量散在神經(jīng)元中表達(圖1)，而TNF-α僅表達于膠質(zhì)細胞中(圖2)。與control組比較，7 d PTZ組和eTNS組的IL-1β及TNF-α表達差異不顯著，14 d及28 d差異明顯(P＜0.01);與PTZ組比較，eTNS組IL-1β及TNF-α表達在7 d未見明顯差異，但在14 d及28 d，eTNS組IL-1β和TNF-α表達顯著減少(P ＜0.05)，見表2。

Figure 1.The expression of IL-1β at 14 d and 28 d after consecutive electrostimulation.圖1 連續(xù)電刺激14 d和28 d海馬CA1區(qū)IL-1β的表達

Figure 2.The expression of TNF-α at 14 d and 28 d after consecutive electrostimulation.圖2 連續(xù)電刺激14 d和28 d海馬CA1區(qū)TNF-α的表達

3 ELISA定量分析

Control組大鼠海馬IL-1β及TNF-α蛋白含量甚微;PTZ點燃后，與control組比較，各時點PTZ組和eTNS組的IL-1β及TNF-α蛋白含量增加明顯(P＜0.01)。與PTZ組比較，刺激后7 d，eTNS組的 IL-1β及TNF-α蛋白含量無明顯差異(P＞0.05);而刺激后14 d，eTNS組的IL-1β及TNF-α蛋白含量顯著減少(P ＜0.05);刺激后28 d，eTNS組的IL-1β 及 TNF-α蛋白含量減少更明顯(P＜0.01)，見圖3、4。

Figure 3.Comparison of the content of IL-1β in hippocampus at different time points among control group，PTZ group and eTNS group.Mean ± SD.n=6.＊＊P ＜0.01 vs control group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs PTZ group.圖3 不同時點control組、PTZ組和eTNS組間海馬IL-1β蛋白含量的比較

討 論

最新研究報道經(jīng)皮三叉神經(jīng)電刺激這一技術(shù)在美國已初步應(yīng)用于臨床頑固性癲癇病人的治療探索，半數(shù)以上的頑固性癲癇發(fā)作得到顯著改善或完全控制發(fā)作［1］。經(jīng)皮三叉神經(jīng)電刺激在操作方面簡便易行，無明顯的心血管不良事件發(fā)生［11］，在便利性和經(jīng)濟性方面明顯優(yōu)于腦深部電刺激、脊髓電刺激和迷走神經(jīng)電刺激，對其抗癲癇作用及具體機制的進一步探索具有重要的理論和實踐意義。

Figure 4.Comparison of the content of TNF-α in hippocampus at different time points among control group，PTZ group and eTNS group.Mean ± SD.n=6.＊＊P ＜0.01 vs control group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs PTZ group.圖4 不同時點control組、PTZ組和eTNS組間海馬TNF-α蛋白含量的比較

既往的研究表明，癲癇與細胞因子密切相關(guān)，癲癇持續(xù)狀態(tài)導(dǎo)致海馬區(qū)神經(jīng)元選擇性死亡，同時引起海馬區(qū)炎癥細胞因子的改變［12］。目前認為，促炎癥細胞因子IL-1β及其受體在癲癇形成中起到關(guān)鍵作用，IL-1β的產(chǎn)生促進了癲癇的形成［7-8］。藥物研究明確證實抑制IL-1β生物合成減弱了小鼠的自發(fā)性發(fā)作［13］。實驗研究表明，TNF-α作為一種經(jīng)典的促炎癥細胞因子，能調(diào)整突觸的傳遞，尤其是膠質(zhì)細胞釋放的TNF-α，可以通過調(diào)整神經(jīng)元表面的α-氨基羥甲基惡唑丙酸受體，加快突觸的傳遞，并且通過與不同受體調(diào)整與谷氨酸能系統(tǒng)相互作用，調(diào)整神經(jīng)興奮性，進而影響癲癇發(fā)生的敏感性［14-15］。

PTZ通過影響氯離子通道活性從而使神經(jīng)元過度興奮，引起癲癇發(fā)作。PTZ引起的慢性癲癇發(fā)作與人類的自發(fā)性癲癇較為類似，可引起與人類較為相似的行為和神經(jīng)病理的改變［16］。本研究經(jīng)皮三叉神經(jīng)電刺激組較致癇組大鼠在行為學(xué)上的表現(xiàn)明顯減輕，并且刺激組動物海馬IL-1β和TNF-α蛋白的表達明顯減少，表明經(jīng)皮三叉神經(jīng)電刺激減少致癇細胞因子IL-1β和TNF-α的合成與釋放，減弱中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性，減輕致癇動物的腦損傷，進而可能影響癲癇的形成。有關(guān)三叉神經(jīng)刺激與中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥調(diào)節(jié)機制尚未明確，需進一步探索，經(jīng)皮三叉神經(jīng)電刺激可能為癲癇的防治提供新的思路。

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