微鈣化動(dòng)脈粥樣硬化斑塊兔模型的建立與染色方法的比較*

郭倩倩，張鵬飛，王琳，孔靜，張運(yùn)，張梅

(山東大學(xué)齊魯醫(yī)院心內(nèi)科，山東濟(jì)南 250012)

·實(shí)驗(yàn)技術(shù)·

微鈣化動(dòng)脈粥樣硬化斑塊兔模型的建立與染色方法的比較*

郭倩倩，張鵬飛△，王琳，孔靜，張運(yùn)，張梅

(山東大學(xué)齊魯醫(yī)院心內(nèi)科，山東濟(jì)南 250012)

目的:建立微鈣化動(dòng)脈粥樣硬化斑塊兔模型，并比較茜素紅S和馮·科薩染色方法對(duì)微鈣化的識(shí)別。方法：30只雄性新西蘭兔，在高脂飼料喂養(yǎng)和腹主動(dòng)脈內(nèi)皮球囊損傷基礎(chǔ)上，隨機(jī)分為套管組(給予腹主動(dòng)脈雙楔形套管縮窄)和非套管組，喂養(yǎng)12周，對(duì)比茜素紅S和馮·科薩染色方法對(duì)微鈣化識(shí)別的價(jià)值，并比較兩組微鈣化的發(fā)生率。結(jié)果:兩組均形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，套管組微鈣化發(fā)生率和鈣化面積高于非套管組(P＜0.05)。茜素紅S和馮·科薩染色識(shí)別微鈣化的敏感性相同，前者具有熒光活性的優(yōu)勢(shì)，但對(duì)于微鈣化的定位準(zhǔn)確性遜于后者。結(jié)論:本研究成功建立了一種微鈣化動(dòng)脈粥樣硬化斑塊兔模型。茜素紅S和馮·科薩染色均能較好識(shí)別微鈣化。

微鈣化;動(dòng)脈粥樣硬化;茜素紅S染色;馮·科薩染色;模型，動(dòng)物

在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)鈣質(zhì)沉積。鈣化對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的作用一直存在爭(zhēng)議。有限元函數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，鈣化并不增加斑塊纖維帽處的局部應(yīng)力，對(duì)斑塊的力學(xué)穩(wěn)定性沒(méi)有影響［1-2］。而近期有學(xué)者發(fā)現(xiàn)斑塊表面的鈣化結(jié)節(jié)，特別是直徑在10 μm以下的微鈣化能增加斑塊易損性，促使斑塊破裂［3-6］。但由于缺乏微鈣化動(dòng)脈粥樣硬化斑塊動(dòng)物模型和敏感的病理學(xué)染色技術(shù)，對(duì)微鈣化與斑塊穩(wěn)定性間關(guān)系的研究有限。

兔腹主動(dòng)脈內(nèi)皮機(jī)械性損傷加高脂飼料喂養(yǎng)是復(fù)制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊常用的動(dòng)物模型，尤其適用于介入性診療技術(shù)的研究。但該模型所形成的斑塊以脂質(zhì)和膠原成分為主，尚未見(jiàn)有微鈣化成分的報(bào)道［7-10］。業(yè)已證實(shí)，血流剪切力的變化不僅參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生［11］，還與斑塊內(nèi)鈣化密切相關(guān)［12］。Cheng等［13］在體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，利用符合流體力學(xué)原理的套管可同時(shí)模擬不同形式的剪切力。故本研究擬在腹主動(dòng)脈內(nèi)皮球囊損傷加高脂飼料喂養(yǎng)的傳統(tǒng)模型基礎(chǔ)上引入腹主動(dòng)脈套管縮窄，改變局部的血流剪切力，以期建立微鈣化動(dòng)脈粥樣硬化斑塊動(dòng)物模型;并利用此模型對(duì)比茜素紅S(alizarin red S)和馮·科薩(von Kossa)這2種常用的鈣質(zhì)染色技術(shù)用于微鈣化染色的可行性和異同點(diǎn)。

材料和方法

1 動(dòng)物與模型建立

雄性純種新西蘭兔30只，體重1.5～2.5 kg(購(gòu)自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，合格證號(hào)為魯動(dòng)質(zhì)字D20021135)。隨機(jī)分為套管組和非套管組，每組各15只，均給予2%高膽固醇飼料喂養(yǎng)12周，并按課題組前期發(fā)表的方法［7］，于第1周末，經(jīng)股動(dòng)脈入路，以充盈球囊反復(fù)損傷腹主動(dòng)脈內(nèi)膜3次。在套管組，球囊損傷操作結(jié)束后，開(kāi)腹，于右腎動(dòng)脈開(kāi)口下方2 cm處分離腹主動(dòng)脈并置入硅膠材質(zhì)的雙楔形套管，見(jiàn)圖1。

2 血流剪切力檢測(cè)

在球囊損傷操作前和第12周末利用超聲(GE公司Vivid q彩色超聲儀，探頭8L-RS，頻率4.0～13.0 MHz)對(duì)套管組近心端、套管內(nèi)最狹窄處、套管遠(yuǎn)心端部位的腹主動(dòng)脈和非套管組相應(yīng)部位的腹主動(dòng)脈進(jìn)行長(zhǎng)軸和橫切面掃查，分別測(cè)量舒張末期內(nèi)徑(diastolic diameter，Dd)和平均血流速度(mean flow velocity，Vm)。同時(shí)自兔耳緣靜脈抽血，于2 h內(nèi)完成血液黏滯度(η)測(cè)定(中外合資北京中勤世帝公司LG-R-80全自動(dòng)流變儀)，并按下述公式計(jì)算血流剪切力(fluid shear stress，τm):τm=η×4×Vm/ Dd。

3 取材

第12周末，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉成功后開(kāi)腹，分離腹主動(dòng)脈全長(zhǎng)，隨后經(jīng)耳緣靜脈注射過(guò)量3%戊巴比妥鈉安樂(lè)死處死動(dòng)物，并立即將灌注針插入右腎動(dòng)脈開(kāi)口水平稍下方的腹主動(dòng)脈腔內(nèi)，下腔靜脈剪小口，以4%多聚甲醛行腹主動(dòng)脈局部灌注固定。取套管近心端、套管內(nèi)及遠(yuǎn)心端的腹主動(dòng)脈，修剪成2mm長(zhǎng)的小塊后至于預(yù)冷的4%多聚甲醛中，4℃下充分固定48 h;在非套管組，則取對(duì)應(yīng)于套管組套管近心端至套管遠(yuǎn)心端之間的腹主動(dòng)脈為樣本。

4 常規(guī)病理學(xué)及免疫組織化學(xué)染色

固定后的腹主動(dòng)脈，分別進(jìn)行石蠟和冰凍包埋，以5 μm厚度制片，行HE、天狼星紅、油紅O染色和抗β-肌動(dòng)蛋白(武漢博士德生物工程有限公司)、抗巨噬細(xì)胞(monoclonal mouse anti-rabbit macrophage，clone RAM11;Dako)免疫組織化學(xué)染色以顯示斑塊內(nèi)的膠原纖維、脂質(zhì)、平滑肌成分和巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)。

5 微鈣化染色

連續(xù)2張石蠟切片分別行茜素紅S染色和馮·科薩染色。

5.1 茜素紅S染色石蠟切片常規(guī)脫蠟后置入0.5%茜素紅S溶液30 min，蒸餾水速洗3次，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，環(huán)保樹(shù)膠封片。

5.2 馮·科薩染色石蠟切片常規(guī)脫蠟后置入1% AgNO3溶液，紫外線下照射30 min，蒸餾水速洗3次，加入5%硫代硫酸鈉5 min去除未反應(yīng)的銀，蒸餾水速洗3次后加入0.1%核固紅溶液1 min復(fù)染細(xì)胞核，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，環(huán)保樹(shù)膠封片。

6 微鈣化的觀察與分析

茜素紅S和馮·科薩染色的切片，先后在激光共聚焦顯微鏡(ZEISS LSM 710)和光學(xué)顯微鏡(Leica DM2500)下觀察。在60倍光學(xué)顯微鏡下選取相同視野拍照，以Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件計(jì)算鈣化面積占斑塊面積的百分比。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。兩組間比較采用t檢驗(yàn)。多組間比較采用單因素方差分析。計(jì)數(shù)資料采用Fisher精確檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

套管組因手術(shù)意外死亡3只，術(shù)后腹瀉死亡3只，2組分別有9和15只完成實(shí)驗(yàn)。

12 組間血流剪切力的比較

非套管組兔球囊損傷操作前與12周末腹主動(dòng)脈血流剪切力間無(wú)顯著差異［(33.19±3.30)dyn/cm2vs(27.86±4.17)dyn/cm2，P＞0.05］。而套管組，12周末時(shí)套管近心端的剪切力顯著低于球囊損傷操作前，構(gòu)建出低剪切力模型;套管內(nèi)的剪切力明顯高于球囊損傷操作前，構(gòu)建出高剪切力模型;而套管遠(yuǎn)心端的剪切力顯著低于球囊損傷操作前且彩色多普勒超聲顯示紊亂的血流圖像，提示存在振蕩剪切力，見(jiàn)圖2、表1。

Figure 2.Color Doppler ultrasonography of the cast-placement group before surgery(A)and 12 weeks after surgery (B).圖2 套管組術(shù)前(A)術(shù)后(B)血流圖

表1 套管組術(shù)前、術(shù)后各部位血流剪切力的比較Table 1.Comparison of the shear stress between pre-and postsurgery in the group with the abdominal cast(dyn/cm2.Mean±SD)

22 組間動(dòng)脈粥樣硬化斑塊組成成份的比較

12周末非套管組和套管組近心端、遠(yuǎn)心端處腹主動(dòng)脈均發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成。病理學(xué)染色結(jié)果表明套管組近心端和遠(yuǎn)心端巨噬細(xì)胞、膠原纖維的含量均顯著高于非套管組，而平滑肌細(xì)胞、脂質(zhì)含量與非套管組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;套管組近心端與遠(yuǎn)心端各種組織含量間無(wú)顯著差異，見(jiàn)圖3。

Figure 3.Comparison of different components in the atherosclerotic plaques between non-cast-placement and cast-placement groups at the 12th week.Histological changes of the abdominal aortas were observed(HE staining)，and the atherosclerotic plaques were stained for macrophages(anti-RAM11)，vascular smooth muscle cells(VSMCs;anti-β-actin)，collagen(Sirius red staining)or lipids(oil red O staining).Scale bar=20 μm.Mean±SD.*P＜0.05 vs non-cast-placement group.圖3 2組間動(dòng)脈粥樣硬化斑塊組成成份的比較

32 組間微鈣化發(fā)生率的比較

非套管組只有1只兔的1個(gè)部位發(fā)生微鈣化，鈣化面積為0.12%;而套管組中有4只兔共計(jì)10個(gè)部位發(fā)生微鈣化，均位于套管近心端和遠(yuǎn)心端，鈣化面積平均為0.27%。套管內(nèi)高剪切力區(qū)域未發(fā)現(xiàn)微鈣化。2組的鈣化率有顯著差異(P＜0.05)，見(jiàn)圖4。

42 種染色方法對(duì)微鈣化的識(shí)別比較

4.1 普通光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果2種染色方法均可識(shí)別斑塊內(nèi)微鈣化，且2種染色方法測(cè)得的鈣化面積并無(wú)顯著差異(P＞0.05)，見(jiàn)圖5。

Figure 5.Comparison of the calcification area index measured by alizarin red S and von Kossa staining.Mean±SD.n= 5.圖5 2種染色方法測(cè)得的鈣化面積比較

馮·科薩染色下，微鈣化為黑灰色或黑色，細(xì)胞核為粉紅色，細(xì)胞輪廓清楚，組織結(jié)構(gòu)清晰，60倍鏡下可分辨出細(xì)胞內(nèi)鈣化與細(xì)胞外基質(zhì)鈣化，見(jiàn)圖6B、D。茜素紅S染色技術(shù)將鈣化染為粉紅或紅色，但由于該技術(shù)不能復(fù)染細(xì)胞核，細(xì)胞輪廓不清晰，鈣化部位定位不準(zhǔn)確，見(jiàn)圖6A、C。

Figure 6.Microcalcification stained by alizarin red S(A，C)and von Kossa(B，D).Microcalcification was black or black-grey signals under von Kossa staining whereas vivid red signals under alizarin red S staining.Both cellular(blue arrow)and extracellular(green arrow) microcalcification could be observed with von Kossa straining.Black arrow points to the nucleus.Scale bars represent 100 μm in A and B，and 20 μm in C and D.圖6 光學(xué)顯微鏡下觀察微鈣化

4.2 激光共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果茜素紅S染色的切片在共聚焦圖片中，背景的自發(fā)熒光可忽略，陽(yáng)性信號(hào)為紅色，對(duì)比鮮明，見(jiàn)圖7A。在本研究建立的動(dòng)物模型中可見(jiàn)球形和長(zhǎng)條形2種形態(tài)的微鈣化，直徑范圍自1～15 μm不等，見(jiàn)圖7B、C。馮·科薩染色無(wú)熒光活性，無(wú)法在激光共聚焦掃描顯微鏡下成像觀察。

討論

動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂和繼發(fā)血栓形成是急性心血管事件的主要病因。在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展過(guò)程中伴隨著鈣化的發(fā)生:早期，平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的凋亡與壞死可導(dǎo)致細(xì)胞水平或亞細(xì)胞水平的微鈣化;中晚期，脂質(zhì)核心形成，在壞死區(qū)域可出現(xiàn)較大的鈣化顆粒，最終可發(fā)生骨化。鈣化對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的影響愈發(fā)受到關(guān)注。Vengrenyuk等［3］利用Goodier數(shù)學(xué)模型證實(shí)薄纖維帽處的微鈣化可使其周?chē)膽?yīng)力加倍，引起界面的分離，導(dǎo)致斑塊破裂。Bluestein等［4］利用流固耦合(fluid-structure interaction，F(xiàn)SI)模型提出微鈣化能增加局部應(yīng)力并導(dǎo)致斑塊破裂的理論假說(shuō)。但由于缺少適宜的微鈣化動(dòng)脈粥樣硬化斑塊動(dòng)物模型及可識(shí)別微鈣化的病理學(xué)染色方法，這些理論模型的體內(nèi)驗(yàn)證研究受到限制。

Figure 7.Microcalcification observed under laser scanning confocal microscope.Microcalcification was shown as vivid red signals in two-dimensional image(A).Spherical and rectangular microcalcification could be illustrated with three-dimensional reconstructed images(B and C).Cartoons inserted at the right upper corner of each image demonstrated the location of the microcalcification within the atherosclerotic plaque.The blue area represents the plaque.Red spots represent microcalcification.圖7 激光共聚焦顯微鏡觀察微鈣化

傳統(tǒng)的高脂飼料喂養(yǎng)加腹主動(dòng)脈內(nèi)皮球囊損傷的兔模型中，可見(jiàn)斑塊內(nèi)富含脂質(zhì)、膠原，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)亦可在該類(lèi)動(dòng)物模型中得以復(fù)制，但鈣化發(fā)生較少［7-10］。本研究證實(shí)，腹主動(dòng)脈套管縮窄導(dǎo)致血流剪切力的改變，而剪切力與鈣化發(fā)生密切相關(guān)。Stefan等［12］通過(guò)血管內(nèi)超聲及虛擬組織顯像技術(shù)分析冠狀動(dòng)脈分支處斑塊負(fù)荷及組織成份，發(fā)現(xiàn)在分支的對(duì)側(cè)壁，即一般認(rèn)為的低剪切力區(qū)，斑塊負(fù)荷大且鈣化嚴(yán)重。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之相符，套管近心端與遠(yuǎn)心端為低剪切力區(qū)且微鈣化發(fā)生明顯增加。同時(shí)，本研究證實(shí)振蕩剪切力促進(jìn)微鈣化的發(fā)生，這在文獻(xiàn)中鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在傳統(tǒng)模型存在的高脂環(huán)境和內(nèi)皮炎癥基礎(chǔ)上，剪切力導(dǎo)致斑塊內(nèi)微鈣化發(fā)生率增加，成功建立了一種適合研究微鈣化動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的動(dòng)物模型。

茜素紅S和馮·科薩是常用的鈣質(zhì)染色技術(shù)。茜素紅S通過(guò)結(jié)構(gòu)中的硫酸基團(tuán)及羥基基團(tuán)與鈣離子反應(yīng)形成粉紅色或紅色鈣鹽［14］。茜素紅S染料可自發(fā)紅色熒光，呈色反應(yīng)可借助激光共聚焦顯微鏡觀察［3］。馮·科薩染色利用硝酸銀溶液與鈣鹽的磷酸根或碳酸根反應(yīng)生成相應(yīng)的磷酸銀或碳酸銀，后者可被日光或者紫外線還原為黑灰或黑色的金屬銀［14］。本研究證實(shí)2種方法同樣適用于微鈣化染色，對(duì)微鈣化的敏感性相同。馮·科薩染色顏色對(duì)比鮮明，組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)清楚，能明確微鈣化發(fā)生于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外基質(zhì)。茜素紅S是一種陰離子蒽醌類(lèi)染料，具有自發(fā)熒光，可通過(guò)激光共聚焦掃描顯微鏡觀察，利用其在深度識(shí)別能力(最大深度為200～400 μm)和縱向分辨率的優(yōu)勢(shì)，進(jìn)行三維重建，靈活、直觀地顯示微鈣化的空間形態(tài)［15］，且茜素紅S的熒光活性可用于流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)，對(duì)細(xì)胞、分子水平的研究提供便利，但茜素紅S染色不能準(zhǔn)確顯示細(xì)胞核，對(duì)于鈣化位置的定位有一定的局限性。鑒于微鈣化的位置及形狀對(duì)斑塊穩(wěn)定性有各異的作用［3，5］，2種染色技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用對(duì)于全面分析微鈣化與斑塊穩(wěn)定性間的關(guān)系更具價(jià)值。

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Development of a New Zealand rabbit model of microcalcified atherosclerotic plaques and comparison of staining methods for determining microcalcification

GUO Qian-qian，ZHANG Peng-fei，WANG Lin，KONG Jing，ZHANG Yun，ZHANG Mei
(Department of Cardiology，Qilu Hospital of Shandong University，Jinan 250012，China.E-mail:pengf-zhang@163.com)

AIM:To develop a New Zealand rabbit model of microcalcified atherosclerotic plaques and to compare alizarin red S staining and von Kossa staining for identifying the microcalcification.METHODS:Thirty New Zealand rabbits were randomly divided into cast-placement group and non-cast-placement group.All animals were fed with high-cholesterol diets and underwent aortic endothelial denudation.Double-wedge-shaped casts were implanted around the aorta in the animals in cast-placement group.At the end of the 12th week，the rabbits were sacrificed and the arterial samples were collected to stain the possible microcalcification within the plaques by the techniques of alizarin red S staining and von Kossa staining.RESULTS:Atherosclerotic plaques were found in abdominal aorta in both groups.Microcalcification was evidenced more frequently in cast-placement group，and the calcification area index was also much larger.The alizarin red S staining and von Kossa staining had similar sensitivity for identifying microcalcification.The von Kossa staining was superior to illuminate the accurate localization of the microcalcification，while the alizarin red S staining held the benefit of fluorescence.CONCLUSION:A new animal model of microcalcified atherosclerotic plaques is developed successfully.Both alizarin red S staining and von Kossa staining could be used to identify microcalcification sensitively.

Microcalcification;Atherosclerosis;Alizarin red S staining;von Kossa staining;Models，animal

R541.4

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.02.034

1000-4718(2014)02-0374-06

2013-09-16

2013-12-14

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究計(jì)劃(973)項(xiàng)目(No.2010CB732605);國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30972809)

△通訊作者Tel:0531-82169429;E-mail:pengf-zhang@163.com