十一方藥酒回流提取制備工藝優(yōu)選*

莫小林，伍小燕，龔敏陽，陳曉明，譚冬冬

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，南寧 530023；2.廣西醫(yī)科大學(xué)2010級(jí)藥學(xué)4班，南寧 530023)

十一方藥酒回流提取制備工藝優(yōu)選*

莫小林1，伍小燕1，龔敏陽1，陳曉明1，譚冬冬2

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，南寧 530023；2.廣西醫(yī)科大學(xué)2010級(jí)藥學(xué)4班，南寧 530023)

目的 優(yōu)選十一方藥酒回流提取制備工藝。方法以白酒濃度、白酒用量、提取時(shí)間為考察因素,以十一方藥酒人參皂苷Rg1、大黃酚、山柰素的含量及總固體量為指標(biāo),采用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選十一方藥酒回流提取工藝。結(jié)果十一方藥酒回流提取最佳工藝參數(shù)為6倍量50%白酒提取3 h。結(jié)論優(yōu)選的制備工藝合理可行,可為十一方藥酒的制備工藝選擇提供參考。

十一方藥酒；人參皂苷Rg1；大黃酚；山柰素；正交實(shí)驗(yàn)

十一方藥酒為我院制劑室的制劑品種,由重樓、三七、紅花、煅自然銅、乳香、秦艽、沒藥、續(xù)斷、大黃、制馬錢子等多味中藥組成,全方具有活血散瘀、舒筋活絡(luò)、消腫鎮(zhèn)痛、祛風(fēng)除濕等作用,臨床用于跌打扭傷,各種骨折、骨傷,風(fēng)濕骨痛等癥,療效顯著。目前較常用的酒劑的制備方法為浸漬法、滲漉法、回流提取法或其他適宜方法［1］。我院十一方藥酒的制備方法為浸漬法,該法存在生產(chǎn)周期長、溶劑揮發(fā)較多、藥液損耗大等缺點(diǎn)。筆者采用正交實(shí)驗(yàn)法考察回流提取十一方藥酒,為十一方藥酒的制備工藝選擇提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津DCU-20A5高效液相色譜儀；島津SPD-20A紫外檢測儀；GH-252電子分析天平(廣州市艾安得儀器有限公司)；CD-UPT-II-10L超純水制造系統(tǒng)(成都超純科技有限公司)；KQ3200E 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 人參皂苷Rg1對照品(批號(hào):110703-201027,含量96.3%),大黃酚對照品(批號(hào):110796-201118,含量99.5%),山柰素對照品(批號(hào)110861-201209,含量95.9%)均購自中國食品藥品檢定研究院。十一方藥酒(每瓶100 mL,批準(zhǔn)文號(hào):桂藥制字Z01060025,批號(hào):20120305,20120416,20120518)由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室制備。乙腈(J.T. Baker,批號(hào):12090072)、甲醇(J.T.Baker,批號(hào): 12125062)、磷酸(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所,批號(hào): 20110103)均為色譜純,水為超純水,其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 回流提取十一方藥酒的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用L9(33)正交表進(jìn)行正交設(shè)計(jì),對白酒濃度、白酒用量、提取時(shí)間進(jìn)行考察,以人參皂苷Rg1含量、大黃酚含量、山柰素含量和總固體量為考察指標(biāo),進(jìn)行回流提取,實(shí)驗(yàn)方案見表1。

2.2 樣品溶液的制備 按處方量稱取十一方藥酒各藥材,按L9(33)實(shí)驗(yàn)列號(hào)各條件分別回流提取,濾過,定容至1 000 mL,放置備用。

2.3 總固體量的測定 精密量取各樣品溶液50 mL,置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中,水浴上蒸干,在105℃干燥3 h,移至干燥器中,冷卻30 min,迅速精密稱定質(zhì)量,計(jì)算總固體量［2］。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Tab.1 Levels and factors of or thogonal design

2.4 人參皂苷Rg1的含量測定

2.4.1 色譜條件 色譜柱:WondaSil C18Superb (4.6 mm×250 mm,5μm)；流動(dòng)相:乙腈-0.05%磷酸溶液(22∶78)；檢測波長205 nm；流速1.0 mL·min-1,進(jìn)樣量:20μL；柱溫:30℃。在此條件下人參皂苷Rg1可與其他峰完全分離,保留時(shí)間約為20.8 min,理論板數(shù)不低于5 000。

2.4.2 溶液制備 ①對照品溶液制備:精密稱取人參皂苷Rg1對照品2.1 mg置10 mL量瓶中,加甲醇制成每毫升含0.21 mg人參皂苷Rg1的對照品溶液；②供試品溶液的制備:精密吸取十一方藥酒3.0 mL,水浴蒸干至無醇味,加水15 mL溶解,過濾,濾液用乙醚萃取2次,每次10 mL,棄去乙醚液,水溶液用水飽和的正丁醇萃取3次,每次8 mL,合并正丁醇液,超聲處理30 min,用5%氫氧化鈉溶液洗滌兩次,每次10 mL,合并正丁醇液,水浴蒸干,殘?jiān)眉状既芙庥?5 mL量瓶中,搖勻,經(jīng)孔徑0.45μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液。即得。

2.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密吸取人參皂苷Rg1對照品溶液各0.1,0.4,0.8,1.2,1.6,2.0 m L,置10 m L量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,吸取上述溶液,各進(jìn)樣20μL,連續(xù)進(jìn)樣3次。以濃度為橫坐標(biāo),峰面積積分值為縱坐標(biāo)繪制工作曲線?；貧w方程為Y=3 237X+ 323.41,r=0.999 8,線性范圍在2.1～42.0μg·mL-1,呈良好的線性關(guān)系。

2.4.4 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取人參皂苷Rg1對照品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6次,測定人參皂苷Rg1峰面積積分值,其RSD為1.15%,表明儀器精密度良好。

2.4.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取供試品溶液,分別于配制后0,1,2,4,8,12,24 h進(jìn)樣,供試品溶液24 h中峰面積值無明顯變化,RSD為0.72%,表明供試品溶液中人參皂苷Rg1在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3)掘進(jìn)機(jī)負(fù)壓降塵裝置可有效吸附掘進(jìn)機(jī)掘進(jìn)過程的灰塵，有效保障煤礦井下作業(yè)人員的身心健康和工作場所的作業(yè)安全。

2.4.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批十一方藥酒(批號(hào)20120305)樣品6份,分別按供試品溶液制備方法操作,進(jìn)樣20μL,測定峰面積積分值,計(jì)算人參皂苷Rg1的平均含量為0.258 mg·m L-1,RSD為0.90%。

2.4.7 加樣回收實(shí)驗(yàn) 采用加樣回收法,精密吸取已知含量的同一批號(hào)(20120416)樣品6份,每份1.0 mL,分別加入濃度為0.583 mg·mL-1的人參皂苷Rg1對照品溶液0.4 mL,按供試品溶液的制備項(xiàng)下的方法提取并測定,計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率為96.7%,RSD為1.68%。

2.5 大黃酚的含量測定

2.5.1 色譜條件 色譜柱:WondaSil C18Superb (4.6 mm×250 mm,5μm)；流動(dòng)相:甲醇-0.1%磷酸水溶液(84∶16)；檢測波長254 nm；流速1.0 mL·min-1,進(jìn)樣量:20μL；柱溫:30℃。保留時(shí)間約為13.7 min,理論板數(shù)不低于6 000。

2.5.2 溶液制備 ①對照品溶液制備:精密稱取大黃酚對照品0.205 mg置10 mL量瓶中,加甲醇制成每毫升含20.5μg大黃酚的對照品溶液；②供試品溶液的制備:精密吸取十一方藥酒3.0 mL,水浴蒸干至無醇味,加入10%鹽酸溶液20 mL,超聲處理30 min,用三氯甲烷溶液萃取3次,每次10 mL,合并三氯甲烷溶液,加2%碳酸鈉溶液洗滌,棄去碳酸鈉液層,三氯甲烷層用20 mL水洗滌,棄去水層,三氯甲烷層水浴揮干,甲醇定容于10 mL量瓶中,搖勻,經(jīng)孔徑0.45μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液。即得。

2.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密吸取大黃酚對照品溶液各0.1,0.3,0.8,1.4,2.0 m L,置5 mL量瓶,用甲醇稀釋至刻度,吸取上述溶液,各進(jìn)樣20μL,連續(xù)進(jìn)樣3次。以濃度為橫坐標(biāo),峰面積積分值為縱坐標(biāo)繪制工作曲線。回歸方程為Y=77 726X+7 175.1,r= 0.999 9,線性范圍在0.41～8.20μg·mL-1呈良好的線性關(guān)系。

2.5.4 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取大黃酚對照品溶液,重復(fù)進(jìn)樣6次,測定大黃酚峰面積積分值,其RSD為0.79%。

2.5.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取供試品溶液,分別在0,1,4, 8,12,24 h進(jìn)樣,每次20μL,供試品溶液24 h中峰面積值無大變化,RSD為1.06%,表明供試品溶液中的大黃酚在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批樣品(批號(hào): 20120305),平行制備大黃酚供試品溶液6份,分別進(jìn)樣,每次20μL,測定峰面積積分值,計(jì)算大黃酚的平均含量為15.1μg·mL-1,RSD為1.53%。

2.5.7 加樣回收實(shí)驗(yàn) 精密吸取已知含量的同一批號(hào)(20120416)樣品6份,每份10.0 mL,分別加入0.163 mg·mL-1大黃酚對照品溶液為1.0 mL,按照“2.5.2”項(xiàng)供試品溶液的制備項(xiàng)下的方法提取并測定,計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率為97.6%,RSD為1.46%。

2.6 山柰素的含量測定

2.6.1 色譜條件 色譜柱:WondaSil C18Superb (4.6 mm×250 mm,5μm)；流動(dòng)相:甲醇-0.4%磷酸水溶液(58∶42)；檢測波長368 nm；流速1.0 m L·min-1,進(jìn)樣量:20μL；柱溫:30℃。保留時(shí)間約為12.5 min,理論板數(shù)不低于4 000。

2.6.2 溶液制備 ①對照品溶液制備:精密稱取山柰素對照品0.109 mg,置100 mL量瓶中,加甲醇制成每毫升含1.09μg山柰素的對照品溶液；②供試品溶液的制備:精密吸取十一方藥酒10 m L,水浴蒸干至無醇味,加30%鹽酸3 mL和甲醇15 mL,加熱回流30 min,放冷,移至25mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

2.6.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密吸取山柰素對照品溶液各0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mL,置5 mL量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,吸取上述溶液,各進(jìn)樣20μL,連續(xù)進(jìn)樣3次。以濃度為橫坐標(biāo),峰面積積分值為縱坐標(biāo)繪制工作曲線?；貧w方程為Y=201 101X-387,r=0.999 7,線性范圍在0.043 6～0.218 0μg·mL-1呈良好的線性關(guān)系。

2.6.4 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取山柰素對照品溶液,重復(fù)進(jìn)樣6次,測定山柰素峰面積積分值,其RSD為0.98%。

2.6.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取供試品溶液,分別在0,4,8, 12,24 h進(jìn)樣,每次20μL,供試品溶液24 h中峰面積值無大變化,RSD為1.35%,表明供試品溶液中的山柰素在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批樣品(批號(hào): 20120305),平行制備山柰素供試品溶液6份,分別進(jìn)樣,每次20μL,測定峰面積積分值,計(jì)算山柰素的平均含量為0.161μg·m L-1,RSD為1.69%。

2.6.7 加樣回收實(shí)驗(yàn) 精密吸取已知含量的同一批號(hào)(20120416)樣品6份,每份7.0 mL,分別加入濃度為1.09 mg·mL-1的山柰素對照品溶液1.0 mL,按“2.6.2”項(xiàng)供試品溶液的制備項(xiàng)下的方法提取并測定,計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率為98.4%,RSD為1.77%。

2.7 測定法 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20μL,注入液相色譜儀,分別測定并計(jì)算樣品中人參皂苷Rg1、大黃酚和山柰素的含量。結(jié)果見表2。

2.8 結(jié)果 中藥有效成分是中藥復(fù)方發(fā)揮治療作用的物質(zhì)基礎(chǔ)［3］,而總固體量影響制劑澄清度和成品穩(wěn)定性。故選擇人參皂苷Rg1、大黃酚和山柰素作為評價(jià)指標(biāo)權(quán)重系數(shù)均為0.3,總固體量作為評價(jià)指標(biāo),權(quán)重系數(shù)為0.1。綜上所述,以人參皂苷Rg1含量、大黃酚含量、山柰素含量及總固體量為指標(biāo),計(jì)算得出綜合評分［4］并進(jìn)行分析,結(jié)果及方差分析見表2,3。

根據(jù)各因素的極差值(R)顯示,影響十一方藥酒熱回流提取效果的因素順序?yàn)锽>A>C,即溶劑用量>溶劑濃度>提取時(shí)間。其中因素B對實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著性影響,因素A與C對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較?。唤Y(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果、溶劑回收、節(jié)約時(shí)間等因素,最終確定回流提取最優(yōu)工藝條件為A2B2C1,即6倍量50%的白酒回流提取3 h。

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.2 Or thogonal design and results

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

2.9 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按回流提取最佳工藝條件提取,制備3批樣品進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),測定總固體量、人參皂苷Rg1、大黃酚和山柰素的含量。使用最佳驗(yàn)證工藝參數(shù),總固體量達(dá)2.109 1 g,人參皂苷Rg1含量平均為0.264 mg·mL-1,大黃酚含量平均為16.0μg·mL-1,山柰素含量平均為0.160μg·mL-1,接近正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的最高值,說明正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)以該方中三七的主要活性成分人參皂苷Rg1的含量和大黃中大黃酚的含量及紅花中山柰素的含量為主要考察指標(biāo),通過正交實(shí)驗(yàn)對十一方藥酒回流提取工藝進(jìn)行優(yōu)選,同時(shí)結(jié)合總固體量綜合優(yōu)選出最佳提取工藝條件為:6倍量50%白酒提取3 h。

測定人參皂苷Rg1時(shí)分別對甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.5%磷酸溶液等不同比例的流動(dòng)相進(jìn)行了考察,發(fā)現(xiàn)乙腈-0.5%磷酸溶液(22∶78)做流動(dòng)相時(shí)人參皂苷Rg1分離效果最好。測定山柰素時(shí)考察了流動(dòng)相的比例和檢測波長的選擇,結(jié)果選擇甲醇-0.4%磷酸溶液(58∶42)作為流動(dòng)相和波長為370 nm時(shí),山柰素的分離度最高,峰形較對稱。由于水解所用的酸的濃度對結(jié)果影響很大［5］,因此還考察了不同濃度的鹽酸和加酸量的影響,結(jié)果表明加入30%鹽酸3 mL水解完全。

［1］戰(zhàn)渤玉,車緒鳳,尉炳超.中藥酒劑的研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥信息,2010,27(3):120-122.

［2］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:附錄10.

［3］杜冠華.中藥復(fù)方有效成分組學(xué)研究[J].中成藥,2002, 24(11):878-880.

［4］孫學(xué)惠,史國兵,何靜,等.復(fù)方參芪五味咀嚼片制備中五味子與人參的醇提工藝[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2011,30(5):637-639.

［5］朱照靜,鄧開英.舒可心膠囊中總黃酮醇苷的含量測定[J].中國中藥雜志,2003,28(6):569-570.

DOI 10.3870/yydb.2014.01.026

Optimization of Reflux Extraction Process for Shiyifang Vinum

MO Xiao-lin1,WU Xiao-yan1,GONG Min-yang1,CHEN Xiao-ming1,TAN Dong-dong2
(1.Department of Pharmacy,the First Affiliated Hospital ofGuangχi Traditional Chinese Medicine Univeisity,Nanning 530023, China;2.Guangχi Medical University School of Pharmacy,Grade 2010,Class4,Nanning 530023,China)

Objective To optimize the reflux extraction process ofshiyifangvinum.MethodsThe preparation technology ofshiyifangvinum was optimized by adopting orthogonal test on concentration,wine quantity,reflux time as investigation factors and taking ginsenoside Rg1,contentof chrysophanol,kaempferoland totalextraction as references.ResultsThe optimum process of reflux extraction forshiyifangvinum was extracting for 3 hours with six times of wine(50%).ConclusionThe optimized process is reasonable and feasible,which is the good evidence for preparation ofshiyifangvinum.

Shiyifangvinum;Ginsenoside Rg1;Chrysophanol;Kaempferol;Orthogonal test

R286;R283

A

1004-0781(2014)01-0090-04

2013-01-30

2013-04-08

*廣西中醫(yī)藥大學(xué)自然科學(xué)研究項(xiàng)目(P2010028)

莫小林(1974-),女,壯族,廣西南寧人,副主任藥師,學(xué)士,研究方向:制劑開發(fā)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。電話：0771-5645433,E-mail：moxiaolin@163.com。

伍小燕(1962-),女,廣西全州人,主任藥師,學(xué)士,研究方向:從事中藥鑒定和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。電話：0771-5642936,E-mail：yxbwxy@163.com。