雙黃連聯(lián)用左氧氟沙星對(duì)兔組織籠感染模型中金黃色葡萄球菌ATCC29213耐藥性的影響*

王國(guó)俊,葉云,馮碧敏,李虹

(瀘州醫(yī)學(xué)院 1.附屬醫(yī)院藥劑科;2.藥學(xué)院,瀘州 646000)

雙黃連聯(lián)用左氧氟沙星對(duì)兔組織籠感染模型中金黃色葡萄球菌ATCC29213耐藥性的影響*

王國(guó)俊1,葉云1,馮碧敏1,李虹2

(瀘州醫(yī)學(xué)院 1.附屬醫(yī)院藥劑科;2.藥學(xué)院,瀘州 646000)

目的 探討雙黃連聯(lián)合左氧氟沙星對(duì)兔組織籠感染模型中金黃色葡萄球菌ATCC29213對(duì)左氧氟沙星的耐藥性的影響。方法建立兔組織籠感染模型,分別用左氧氟沙星單獨(dú)處理(A組)及雙黃連聯(lián)合左氧氟沙星處理(B組)5 d,探討兔組織籠感染模型中左氧氟沙星在組織液中穩(wěn)態(tài)濃度及經(jīng)處理后兔組織籠中細(xì)菌恢復(fù)生長(zhǎng)的情況和細(xì)菌耐藥性變化。結(jié)果兩組左氧氟沙星在組織液中濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。B組兔組織籠內(nèi)細(xì)菌恢復(fù)生長(zhǎng)發(fā)生率(20%)明顯低于A組(100.0%),而左氧氟沙星對(duì)B組兔組織籠內(nèi)細(xì)菌的最低抑菌濃度(MIC)值明顯低于A組。結(jié)論雙黃連與左氧氟沙星聯(lián)合治療有助于減少金黃色葡萄球菌對(duì)左氧氟沙星的耐藥現(xiàn)象,提示中藥聯(lián)合抗菌藥物可降低細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性。

雙黃連;左氧氟沙星;金黃色葡萄球菌;耐藥性;模型,兔組織籠感染

細(xì)菌等病原微生物感染一直是威脅人類(lèi)健康的重要疾病之一。左氧氟沙星(levofloxacin,LVLX)為氟喹諾酮類(lèi)抗菌藥物,具有廣譜、高效的抗菌活性,臨床應(yīng)用廣泛。然而近年來(lái)細(xì)菌對(duì)氟喹諾酮類(lèi)藥物的耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重。由于自然界中存在的天然耐藥菌只占少數(shù),難以與占大多數(shù)的優(yōu)勢(shì)敏感菌競(jìng)爭(zhēng),只有敏感菌因抗菌藥物的選擇作用而被大量殺滅后,耐藥菌才能大量繁殖成為優(yōu)勢(shì)菌而產(chǎn)生耐藥。耐藥突變選擇窗(mutant selection window,MSW)是最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)與防耐藥變異濃度(mutant prevention concent ration,MPC)之間的濃度范圍,在此范圍內(nèi),耐藥菌株可以被選擇性富集。MSW越寬,越容易出現(xiàn)耐藥菌株;反之,MSW越窄,產(chǎn)生耐藥菌株的可能性越小。MPC提供了抗菌藥物治療中嚴(yán)格限制突變菌株被選擇性擴(kuò)增的抗菌藥物濃度閾值,藥物濃度高于該閾值可有效避免耐藥菌株的選擇性富集。對(duì)于多數(shù)氟喹諾酮類(lèi)藥物包括左氧氟沙星,其MPC遠(yuǎn)大于MIC,要獲得血清或組織藥物濃度超過(guò)MPC很困難[1-2],因此容易導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生。

研究表明即使藥物各自都有非常高的MPC,不同作用機(jī)制的抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用也可縮小或關(guān)閉MSW,從而有效的延緩細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生[3]。但中藥與抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用對(duì)于細(xì)菌MSW的作用筆者鮮見(jiàn)報(bào)道。筆者通過(guò)體外研究發(fā)現(xiàn)雙黃連和左氧氟沙星聯(lián)合用藥有同上述研究結(jié)論一致的結(jié)果,可使左氧氟沙星對(duì)金黃色葡萄球菌(金葡菌)ATCC29213的MSW縮小[4],提示二者聯(lián)用有利于減少細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生。但二者聯(lián)用的體內(nèi)研究筆者尚未見(jiàn)報(bào)道。筆者通過(guò)建立兔組織籠感染模型,考察雙黃連粉針與左氧氟沙星聯(lián)合應(yīng)用對(duì)金葡菌ATCC29213耐藥性的影響?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 普通級(jí)成年健康家兔,雌雄各半,體質(zhì)量2.5～3.0 kg,由瀘州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號(hào):SYXK(川)2008-065,合格證號(hào):川醫(yī)動(dòng)2401115。

1.2 試藥 雙黃連粉針(哈藥集團(tuán)中藥二廠生產(chǎn),規(guī)格:每支600 mg,批號(hào):1003015);鹽酸左氧氟沙星氯化鈉注射液(揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司生產(chǎn),規(guī)格: 0.3 g∶100 mL,批號(hào):11061631);注射用青霉素鈉(華北制藥廠生產(chǎn),規(guī)格:80萬(wàn)U,批號(hào):09013025);3%戊巴比妥鈉(湖北遠(yuǎn)成藥業(yè)有限公司生產(chǎn),規(guī)格:每支0.1 g,批號(hào):YC10000);左氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào):130455-201005,純度: 97.3%);加替沙星(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào): 130518-200402,純度:97.2%);Mueller.Hinton(MH)肉湯、MH瓊脂(杭州天和微生物試劑有限公司,批號(hào): 100804);乙腈為色譜純;磷酸二氫鉀為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)器材 離心機(jī)(長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司,型號(hào):A130102);渦旋混合器(杭州賽智科技有限公司,型號(hào):ST-0246);高效液相色譜儀(型號(hào):UltiMate 3000,戴安,二極管陣列檢測(cè)器),色譜柱:Phenomenex C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司,型號(hào):HH.CP-01);無(wú)菌的多孔、中空的高爾夫練習(xí)球(直徑43 mm)。

1.4 菌株 金葡菌ATCC29213,中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。

1.5 左氧氟沙星對(duì)金葡菌ATCC29213的MIC、MPC測(cè)定 采用瓊脂平板稀釋法,具體見(jiàn)筆者以前的報(bào)道[4]。

1.6 兔組織籠感染模型的建立 成年健康家兔15只,背部去毛,3%戊巴比妥鈉麻醉,皮膚聚維酮碘消毒,皮下植入高爾夫練習(xí)球1個(gè)。2周后手術(shù)傷口愈合,4周后,高爾夫練習(xí)球內(nèi)已充滿(mǎn)清亮的組織液,實(shí)驗(yàn)前一天,用無(wú)菌注射器抽取球內(nèi)液體0.5 mL,取100 μL接種于MH瓊脂平板上,37℃過(guò)夜培養(yǎng),經(jīng)檢驗(yàn)無(wú)菌后,用于建立感染模型。用無(wú)菌注射器往高爾夫練習(xí)球內(nèi)注入1.2×1010CFU對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期金葡菌ATCC29213。2 d后抽取球內(nèi)組織液0.5 mL進(jìn)行細(xì)菌菌落計(jì)數(shù),細(xì)菌濃度在1×108CFU·mL-1以上者用于實(shí)驗(yàn)(經(jīng)測(cè)定,15只兔組織液中細(xì)菌數(shù)目全部符合要求)。感染3 d后開(kāi)始分組處理[5]。

1.7 給藥方法 15只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為3組,每組各5只。A組:單獨(dú)給予左氧氟沙星8 mg·kg-1·d-1; B組:給予注射左氧氟沙星8 mg·kg-1·d-1后再給予雙黃連粉針92 mg·kg-1·d-1;陰性對(duì)照組:給予相應(yīng)量的0.9%氯化鈉溶液。均為耳緣靜脈注射,連續(xù)給藥5 d[6]。

1.8 兔組織籠感染模型中感染部位左氧氟沙星濃度測(cè)定 第5天給藥后2,4,6,8,10 h末取組織液0.35 mL,加入4 μg·mL-1內(nèi)標(biāo)加替沙星50 μL,15%高氯酸蛋白沉淀劑100 μL,渦旋振蕩1 min, 12 000 r·min-1離心10 min,吸取上清液,采用高效液相色譜法測(cè)定組織液中左氧氟沙星濃度。色譜條件: Phenomenex C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動(dòng)相為0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀∶乙腈(80∶20),用磷酸調(diào)至pH4.5,流速1 mL·min-1,紫外檢測(cè)波長(zhǎng)294 nm,柱溫30℃,進(jìn)樣量20 μL[7]。

1.9 兔組織籠感染模型中金葡菌MIC測(cè)定 上述各組處理結(jié)束后48 h抽取組織籠中組織液20 μL,置于培養(yǎng)基中,37℃增菌,觀察細(xì)菌恢復(fù)生長(zhǎng)的情況,對(duì)恢復(fù)生長(zhǎng)細(xì)菌按美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)推薦的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定其左氧氟沙星的MIC。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 不同處理組藥物濃度及金葡菌的MIC比較采用兩個(gè)樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn),P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外測(cè)定 左氧氟沙星對(duì)金葡菌的MIC為0.13 μg·mL-1,MPC為1.30 μg·mL-1,其MSW為0. 13～1.30 μg·mL-1。

2.2 不同時(shí)間兔組織籠感染模型組織液中左氧氟沙星的濃度 由表1可知:A組與B組在給藥10 h后組織液中左氧氟沙星的濃度開(kāi)始低于0.13 μg·mL-1,在給藥2 h至給藥8 h后,兔組織液中的左氧氟沙星均略大于0.13 μg·mL-1,兔組織液中左氧氟沙星濃度至少有25%時(shí)間處于其MSW(0.13～1.30 μg·mL-1)內(nèi)的,其tmsw(tmsw:藥物濃度在MSW內(nèi)的時(shí)間)＞25%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)表明A組與B組左氧氟沙星組織液濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。表明兔組織液中金葡菌耐藥情況的差異并非由于左氧氟沙星濃度差異所致。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)兩組兔組織液中左氧氟沙星的濃度Tab.1 Levofloxacin concentration in two groups of rabbit tissue fluid at different time points μg·mL-1,±s

表1 不同時(shí)間點(diǎn)兩組兔組織液中左氧氟沙星的濃度Tab.1 Levofloxacin concentration in two groups of rabbit tissue fluid at different time points μg·mL-1,±s

組別家兔/只組織液中左氧氟沙星濃度2 h4 h6 h8 h10 h A組50.193±0.0610.180±0.0280.174±0.0260.186±0.0290.092±0.016 B組50.185±0.0450.152±0.0190.169±0.0250.160±0.0250.093±0.024

2.3 不同治療組兔組織籠內(nèi)細(xì)菌恢復(fù)生長(zhǎng)比率 陰性對(duì)照組5只家兔組織液抽取培養(yǎng)后均有細(xì)菌生長(zhǎng),A組單用左氧氟沙星處理的5只家兔組織籠內(nèi)細(xì)菌在處理結(jié)束后均恢復(fù)生長(zhǎng),而B(niǎo)組雙黃連聯(lián)用左氧氟沙星處理的5只家兔僅出現(xiàn)了1例細(xì)菌恢復(fù)生長(zhǎng)。單用左氧氟沙星處理的家兔細(xì)菌恢復(fù)生長(zhǎng)發(fā)生率(100.0%)明顯高于雙黃連聯(lián)用左氧氟沙星處理后的家兔細(xì)菌恢復(fù)生長(zhǎng)率(20.0%)。

2.4 兔組織籠內(nèi)細(xì)菌的耐藥性變化 A組5只家兔組織液中恢復(fù)生長(zhǎng)的細(xì)菌左氧氟沙星對(duì)其的MIC均有明顯升高,MIC為(0.73±0.29)μg·mL-1;B組僅有1只兔中組織液有細(xì)菌恢復(fù)生長(zhǎng),升高為原金葡菌ATCC29213的2MIC,其余4只家兔組織籠內(nèi)未出現(xiàn)細(xì)菌恢復(fù)生長(zhǎng)。將被殺死的金葡菌MIC計(jì)為原金葡菌ATCC29213的MIC(0.13 μg·mL-1),得MIC為(0.16±0.06)μg·mL-1。A組的恢復(fù)生長(zhǎng)細(xì)菌左氧氟沙星MIC顯著高于B組MIC(P＜0.05)。

3 討論

模擬研究人體的兔組織籠模型常用于測(cè)定藥物的組織分布等研究,運(yùn)用感染性家兔模型進(jìn)行藥物動(dòng)力學(xué)研究,可觀察藥物在特定感染組織中的藥效學(xué),也可用于抗菌藥物間在感染條件下的療效比較[8],因此本文建立兔組織籠感染模型用于研究家兔感染部位組織液中藥物濃度。

FIRSOV等[9]研究表明,當(dāng)氟喹諾酮藥物tmsw＞20%治療時(shí)間時(shí),金葡菌的耐藥突變菌株容易被選擇性富集擴(kuò)增,從而導(dǎo)致MIC提高。當(dāng)tmsw≤20%治療時(shí)間時(shí),MIC無(wú)變化。藥物濃度在MSW的不同位置,對(duì)出現(xiàn)耐藥的時(shí)間及耐藥程度均具有明顯的影響。且藥物濃度在MSW的下部時(shí),更容易選擇出耐藥突變菌株。本實(shí)驗(yàn)中A組與B組兔組織液中左氧氟沙星的tmsw＞20%,均位于MSW的下部且兩組家兔組織液中左氧氟沙星濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明兩組中左氧氟沙星均處于容易選擇出耐藥突變菌株的濃度,且兔組織液中金葡菌耐藥情況的差異并非由于左氧氟沙星濃度差異所致。

MSW理論認(rèn)為當(dāng)兩種不同作用機(jī)制的藥物聯(lián)合用藥,并同時(shí)處于各自的MIC之上時(shí),病原菌必須同時(shí)發(fā)生兩種耐藥突變才能生長(zhǎng),因此即使這些藥物各自都有非常高的MPC,也不會(huì)產(chǎn)生耐藥突變。上述兔組織籠感染模型單用左氧氟沙星組(A組)停止給藥后出現(xiàn)了5例細(xì)菌恢復(fù)生長(zhǎng),而雙黃連聯(lián)用左氧氟沙星組(B組)僅出現(xiàn)了1例細(xì)菌恢復(fù)生長(zhǎng)。測(cè)定各組組織液中恢復(fù)生長(zhǎng)的金黃色葡萄球菌MIC可知,雙黃連聯(lián)用左氧氟沙星組細(xì)菌MIC與單用左氧氟沙星組細(xì)菌MIC比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。提示單用左氧氟沙星治療感染,藥物濃度在MSW內(nèi)易誘導(dǎo)細(xì)菌出現(xiàn)耐藥,而具有抗菌作用的中藥與左氧氟沙星聯(lián)用有助于提高治療效果并減少細(xì)菌對(duì)左氧氟沙星的耐藥現(xiàn)象,但由于動(dòng)物體內(nèi)研究具有一定的局限性,上述結(jié)論尚需更深入研究及臨床加以驗(yàn)證。

[1] DRLICA K,MALIK M.Fluoroquionones:action and resistance[J].Current Topics Med Chem,2003,3(3):249-282.

[2] 李朝霞,劉又寧,王睿,等.氟喹諾酮類(lèi)藥物對(duì)金黃色葡萄球菌及其耐藥突變體的耐藥性研究[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué),2006,11(6):696-701.

[3] DRLICA K.The mutant selection window and antimicrobial resistance[J].J Antimicrob Chemother,2003,52(1):11-17.

[4] 王國(guó)俊,葉云,李虹.中藥影響左氧氟沙星對(duì)金黃色葡萄球菌的耐藥突變選擇窗MSW的初步研究[J].中國(guó)藥房, 2012,23(39):3659-3661.

[5] 崔俊昌,劉又寧,王睿.耐藥突變選擇窗與細(xì)菌耐藥的動(dòng)物體內(nèi)研究[J].中華老年多器官疾病雜志,2007,6(5): 339-346.

[6] 周志凌,余細(xì)勇,楊敏,等.左氧氟沙星分散片人體相對(duì)生物利用度及生物等效性研究[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué), 2008,25(3):220-223.

[7] 王國(guó)俊,葉云,龍恩武,等.左氧氟沙星單用及聯(lián)用雙黃連后兔組織液中的濃度差異[J].華西藥學(xué)雜志,2013,28 (3):269-271.

[8] FERNAND Z J,BARRETT J F,LICATA L,et al.Comparisonof efficacies of levofloxacin and oral ciprofloxacin in a rabbit model of a staphylococcal abscess[J].Antimicrob A Gents Chemother,1999,43(3):667-671.

[9] FIRSOV A A,VOSTROV S N,LUBENKO I Y,et al.In vitropharmacodynamic evaluation of the mutant selection window hypothesis using four fluoroquinolones against staphylococcus aureus[J].Antimicrob Agents Chemother,2003,47(5): 1604-1613.

DOI 10.3870/yydb.2014.08.006

Effect of Shuanghuanglian Combined with Levofloxacin on Antibiotic Resistance of Staphylococcus Aureus ATCC29213 in Rabbit Tissue Cage Infection Model

WANG Guo-jun1,YE Yun1,FENG Bi-min1,LI Hong2
(1.Department of Pharmacy,the Affiliated Hospital;2. the Pharmaceutical School,Luzhou Medical College,Luzhou 646000,China)

Objective To explore effects ofshuanghuangliancombined with levofloxacin on antibiotic resistance ofStaphylococcus AureusATCC29213 to levofloxacin.MethodsTissue cage infection model withStaphylococcus aureuswas established in rabbits,and the infected animals were given with levofloxacin alone(group A)or in combination withshuanghuanglian(group B)for 5 days respectively.Steady-state concentration of levofloxacin in tissue cage,bacteria recovery and bacterial resistance in tissue cage infection model were studied.ResultsSteady-state concentration of levofloxacin in tissue cage was not significantly different between group A and group B.The recovery rate of bacteria was significantly lower in group B than in group A(20.0%vs.100.0%).The minimum inhibitory concentration(MIC)was lower in group B than in group A.ConclusionShuanghuangliancombined with levofloxacin is helpful to reduce antibiotic resistance ofStaphylococcus aureusto levofloxacin,indicating that some Chinese traditional medicine combined with antibiotics can reduce antibiotic resistance.

Shuanghuanglian;Levofloxacin;Staphylococcus aureus;Antibiotic resistance;Model,rabbit tissue cage infection

R286;R285.5

A

1004-0781(2014)08-1001-04

2013-03-27

2014-01-10

*楊森科學(xué)研究委員會(huì)中國(guó)分會(huì)研究基金資助項(xiàng)目(JRCC2011藥理02);瀘州醫(yī)學(xué)院青年基金資助項(xiàng)目(瀘醫(yī)院科[2009]1號(hào))

王國(guó)俊(1975-),女,四川瀘州人,副主任藥師,碩士,研究方向:臨床藥學(xué)。電話(huà):0830-3165750,E-mail: wanggj7532@163.com。

葉云(1963-),男,四川瀘州人,教授,學(xué)士,研究方向:臨床藥學(xué)。電話(huà):0830-3165750,E-mail:yeyun8622@ 163.com。