高效液相色譜法測(cè)定四味清口含片中桂皮醛和橙皮苷的含量*

張麗珍,周之榮

(1.廣東藥學(xué)院附屬門診部,廣州 510240;2.廣東藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生檢驗(yàn)與衛(wèi)生化學(xué)系,廣州 510310; 3.廣東省分子流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510310)

高效液相色譜法測(cè)定四味清口含片中桂皮醛和橙皮苷的含量*

張麗珍1,周之榮2,3

(1.廣東藥學(xué)院附屬門診部,廣州 510240;2.廣東藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生檢驗(yàn)與衛(wèi)生化學(xué)系,廣州 510310; 3.廣東省分子流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510310)

目的 建立同時(shí)測(cè)定四味清口含片中桂皮醛和橙皮苷含量的方法。方法采用高效液相色譜法(HPLC):色譜條件為Inertsil ODS-SP(4.6 mm×150 mm,5μm)色譜柱分離,檢測(cè)波長為290 nm,流動(dòng)相為乙腈-水進(jìn)行梯度洗脫,流速為1.0 mL·min-1,柱溫為30℃,理論板數(shù)不低于3 000。結(jié)果桂皮醛進(jìn)樣量在0.025～0.500μg,橙皮苷進(jìn)樣量在0.10～2.00μg范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系均良好;在精密度實(shí)驗(yàn)、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中,桂皮醛和橙皮苷峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1.16%和1.03%,1.27%和1.08%,1.23%和1.28%;桂皮醛的平均加樣回收率為99.24%,RSD為1.65%(n=9),橙皮苷的平均加樣回收率為99.39%,RSD為1.85%(n=9)。結(jié)論該方法具有良好的專屬性和重復(fù)性,加樣回收率實(shí)驗(yàn)符合要求,能準(zhǔn)確、穩(wěn)定地對(duì)四味清口含片中桂皮醛和橙皮苷含量進(jìn)行定量測(cè)定,可作為該制劑的質(zhì)量控制方法。

四味清口含片;桂皮醛;橙皮苷;色譜法,高效液相;含量測(cè)定

四味清口含片處方源于《華佗神方》,由桂心、甘草、細(xì)辛、廣陳皮組成。該方理氣和胃,陽通胃氣和降,芳香化濁除臭,具有防治口臭等功效[1]。由于處方中有幾味中藥的口感不好,為方便患者服用,豐富臨床用藥劑型,本課題組研制了能在口腔內(nèi)緩緩溶化而發(fā)揮對(duì)口臭治療作用的口含片[2]。方中桂心為君藥,桂心為肉桂加工過程中檢下的邊條除去栓皮者,主要含揮發(fā)油桂皮醛等成分。廣陳皮主要成分為橙皮苷、新橙皮苷、對(duì)羥福林、黃酮化合物、揮發(fā)油等。桂心中的桂皮醛含量測(cè)定方法有高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)[3]、氣相色譜(gas chromatography,GC)[4]、薄層色譜法(thin layer chromatography,TLC)[5];廣陳皮中的橙皮苷含量測(cè)定方法有HPLC[6]、超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography,UPLC)[7]、TLC[8]。為有效控制四味清口含片產(chǎn)品質(zhì)量,保證其用藥安全有效,采用HPLC建立該制劑主藥桂心所含主要有效成分桂皮醛和廣陳皮中橙皮苷含量的同時(shí)測(cè)定方法,并對(duì)3批樣品進(jìn)行了含量測(cè)定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Ultimate 3000高效液相自動(dòng)進(jìn)樣色譜儀,紫外檢測(cè)器(Dionex公司);CPA225D電子分析天平(Sartorius公司);KQ-300VDE型三頻數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);U-3010型紫外-可見分光光度計(jì)(日本日立公司)。

1.2 試藥 四味清口含片(批號(hào):20130501, 20130510,20130520)由本實(shí)驗(yàn)室自制;桂皮醛對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院,批號(hào):110710-201012,純度:≥99.5%);橙皮苷對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院,批號(hào):110721-200613,純度:≥98.5%);甲醇、乙腈為色譜醇。實(shí)驗(yàn)用水為雙蒸水;所用其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定指標(biāo)的確定 選擇桂皮醛、橙皮苷作為四味清口含片質(zhì)量控制的指標(biāo)成分進(jìn)行定量研究,建立HPLC同時(shí)測(cè)定四味清口含片中桂皮醛和橙皮苷含量的方法。

2.2 色譜條件 色譜柱:Inertsil ODS-SP(4.6 mm× 150 mm,5μm);流動(dòng)相:乙腈(A)和水(B),梯度洗脫(0～5 min:28%A;～10 min:28%A→35%A;～18 min:65%A;～20 min:35%A→28%A);檢測(cè)波長290 nm;流速1.0 mL·min-1;柱溫:30℃。

2.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取置五氧化二磷(P2O5)干燥器中放置24 h的桂皮醛、橙皮苷對(duì)照品適量,置棕色量瓶中,加甲醇使完全溶解,制成含桂皮醛0.2 mg·mL-1和含橙皮苷0.8 mg·mL-1的混合儲(chǔ)備液。精密量取儲(chǔ)備液配成每毫升中含桂皮醛20μg和含橙皮苷80μg的溶液,作為混合對(duì)照品溶液。

2.4 供試品溶液的制備 取本品10片,研細(xì),過4號(hào)篩,取約0.3 g,精密稱定。置棕色瓶中,精密加入甲醇50 mL,稱定質(zhì)量,超聲提取(功率250W,頻率40 kHz) 20 min,放冷,再稱定質(zhì)量,用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液用孔徑0.45μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得。

2.5 陰性對(duì)照溶液的制備

2.5.1 缺桂心陰性對(duì)照溶液的制備 取處方中除桂心外的其他藥材,按處方劑量及制法和工藝要求制備缺桂心陰性樣品,稱取0.3 g,按“2.4”項(xiàng)下方法制備,即得。

2.5.2 缺廣陳皮陰性對(duì)照溶液的制備 取處方中除廣陳皮外的其他藥材,按處方劑量及制法和工藝要求制備缺廣陳皮陰性樣品,稱取0.3 g,精密稱定。按照“2.4”項(xiàng)下方法制備,即得。

2.5.3 缺桂心和廣陳皮陰性對(duì)照溶液的制備 取處方中除桂心和廣陳皮外的其他藥材,按處方劑量及制法和工藝要求制備缺桂心和廣陳皮陰性樣品,稱取0.3 g,精密稱定。按“2.4”項(xiàng)下方法制備,即得。

2.6 系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn) 分別精密吸取混合對(duì)照品、供試品、缺桂心陰性對(duì)照溶液、缺廣陳皮陰性對(duì)照溶液、缺桂心和廣陳皮陰性對(duì)照溶液各10μL,按“2.2”項(xiàng)條件進(jìn)樣。在該色譜條件下,桂皮醛與橙皮苷和其他成分可達(dá)基線分離,桂皮醛和橙皮苷保留時(shí)間分別為15.2和3.9 min,理論板數(shù)不低于3 000,各成分分離度均＞1.5;不含廣陳皮陰性對(duì)照溶液在橙皮苷出峰區(qū)間未出現(xiàn)相應(yīng)色譜峰,不含桂心陰性對(duì)照溶液在桂皮醛出峰區(qū)間未出現(xiàn)相應(yīng)色譜峰,不含桂心和廣陳皮陰性對(duì)照溶液在桂皮醛、橙皮苷出峰區(qū)間未出現(xiàn)相應(yīng)色譜峰。表明該方法專屬性較好,陰性對(duì)照無干擾。色譜圖結(jié)果見圖1。

2.7 方法學(xué)考察

2.7.1 線性范圍的考察 精密量取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液適量,用甲醇稀釋制成濃度為含桂皮醛分別為2.50, 5.00,10.00,20.00,30.00,40.00,50.00μg·mL-1的系列對(duì)照品溶液(橙皮苷含量分別為10.0,20.0, 40.0,80.0,120.0,160.0,200.0μg·mL-1),搖勻。在“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣10μL,記錄各色譜峰峰面積;以峰面積均值為縱坐標(biāo)(Y)、進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得桂皮醛回歸方程Y=4 148.534X+ 40.763,r=0.999 7,橙皮苷回歸方程Y=2 304.509X+ 126.348,r=0.999 9。結(jié)果顯示,桂皮醛進(jìn)樣量在0.025～0.500μg、橙皮苷進(jìn)樣量在0.10～2.00μg范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系。

2.7.2 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液10μL,在“2.2”項(xiàng)條件下平行測(cè)定6次,記錄桂皮醛和橙皮苷峰面積,平均峰面積分別為862.90, 1 980.82,其RSD分別為為1.16%,1.03%,表明儀器精密度良好。

2.7.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一批(批號(hào): 20130501)供試品溶液,按“2.2”項(xiàng)下色譜條件,分別于0,5,6.5,8,9,12 h進(jìn)樣10μL,測(cè)定記錄峰面積,計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果供試品溶液的桂皮醛平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.27 mg·g-1,RSD為1.27%;橙皮苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13.01 mg·g-1,RSD為1.08%,表明供試品溶液中的桂皮醛和橙皮苷均能夠在12 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.7.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批樣品(批號(hào): 20130501),共取6份、各約0.3 g,精密稱定。按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,平行操作6份,按“2.2”項(xiàng)下色譜條件,測(cè)定峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果桂皮醛平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.27 mg·g-1,RSD為1.23%;橙皮苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13.01 mg·g-1,RSD為1.28%,表明重復(fù)性良好。

A.缺廣陳皮和桂心陰性對(duì)照品;B.缺桂心陰性對(duì)照品;C.缺廣陳皮陰性對(duì)照品;D.桂皮醛和橙皮苷對(duì)照品;E.供試品;1.橙皮苷;2.桂皮醛圖1 四味清口含片中桂皮醛的和橙皮苷的HPLC圖A.negative reference substance without Citrus Chachiensis Hortorum and Cortex Cinnamomi;B.negative reference substance without Cortex Cinnamomi;C.negative reference substance without Citrus Chachiensis Hortorum;D.reference substance of Citrus Chachiensis Hortorum and Cortex Cinnamomi;E.sample;1. hesperidin;2.cinnamaldehydeFig.1 HPLC chromatograms of cinnamaldehyde and hesperidin in siweiqing buccal tablets

2.7.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量的同一批號(hào)(20130501)四味清口含片(約相當(dāng)于桂皮醛3.27 mg·g-1、橙皮苷13.01 mg·g-1)適量,研細(xì),混勻,取約0.25 g,精密稱定,平行取9份,分別置于50 mL棕色量瓶中,再分別精密加入桂皮醛0.2 mg·mL-1和含橙皮苷0.8 mg·mL-1的混合儲(chǔ)備液2.0,2.0,2.0,4.0,4.0,4.0,6.0,6.0,6.0 mL,續(xù)加甲醇適量,超聲處理20 min,取出,放置至室溫,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,用孔徑0.45μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得加樣回收供試品溶液;分別精密吸取10μL,按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,計(jì)算桂皮醛和橙皮苷回收率。桂皮醛的加樣回收率為97.75%～102.02%,平均值為99.24%,RSD為1.65%(n=9),橙皮苷的加樣回收率97.36%～102.42%,平均值為99.39%,RSD為1.85%(n=9)。

2.8 樣品含量測(cè)定 取3批四味清口含片樣品(批號(hào):20130501,20130510,20130520),分別按照“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,每批平行操作3份。分別精密吸取各供試品溶液10μL,注入高效液相色譜儀,按“2.2”項(xiàng)下條件測(cè)定,計(jì)算桂皮醛和橙皮苷含量。結(jié)果3批四味清口含片樣品中桂皮醛含量分別為每片1.63,1.64,1.64 mg,橙皮苷含量分別為每片6.50, 6.51,6.51 mg。

3 討論

3.1 測(cè)定波長的選擇 桂皮醛在290 nm波長處有最大吸收,在220～320 nm波長之間均有吸收,在波長250 nm處吸收比較平滑;橙皮苷在283 nm波長處有最大吸收,為了兼顧桂皮醛和橙皮苷的同時(shí)測(cè)定,本方法在290 nm波長下測(cè)定,橙皮苷的靈敏度也可以滿足準(zhǔn)確測(cè)定的要求。故選擇290 nm為檢測(cè)波長。

3.2 提取方式的選擇 待測(cè)成分桂皮醛屬于易揮發(fā)性物質(zhì),所以提取方式未考慮熱提取法(如回流提取、索氏提取等),文獻(xiàn)[3,9]報(bào)道的提取方式也以超聲提取為主。實(shí)驗(yàn)中對(duì)提取時(shí)間(20,30,40 min)、超聲波儀器的功率和頻率、是否過夜等不同影響因素進(jìn)行逐一考察,結(jié)果顯示:若超聲處理1次,則以20 min為佳,原因是隨著超聲處理時(shí)間的延長,提取液溫度會(huì)有一定程度地升高,已提取出的桂皮醛會(huì)部分揮發(fā)逸失。超聲波儀器的功率對(duì)提取效率影響不大,功率高則提取效率稍高(約3.5%)?！吨腥A人民共和國藥典》2010年版肉桂項(xiàng)下供試品溶液的制備采用“超聲-放置過夜-超聲”的處理方式。本次實(shí)驗(yàn)也將該方法的提取效果與直接超聲提取一次進(jìn)行比較,結(jié)果“超聲-放置過夜-超聲”方式的提取效率只相當(dāng)于直接超聲提取一次的89%?！吨腥A人民共和國藥典》2010年版方法測(cè)定肉桂中的桂皮醛,放置過夜的目的是為了使溶劑充分滲入藥材的組織細(xì)胞內(nèi)部而使桂皮醛充分溶出;而四味清口含片中的桂皮醛則存在于揮發(fā)油的β-環(huán)糊精包合物中,超聲(功率250 W,頻率40 kHz) 20 min足以使其完全溶出,放置過夜反而會(huì)導(dǎo)致桂皮醛逸失而使測(cè)定結(jié)果偏低。綜合上述因素,選擇超聲處理20 min提取桂皮醛,橙皮苷的回收率也能達(dá)到要求。

3.3 流動(dòng)相的選擇 本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-磷酸-水、乙腈-醋酸-水系統(tǒng),結(jié)果表明以乙腈-水為流動(dòng)相梯度洗脫,可以使桂皮醛和橙皮苷的分離良好,峰形也較理想。

3.4 桂皮醛的使用操作 桂皮醛對(duì)光線敏感[10],在實(shí)驗(yàn)過程中采用棕色量瓶配制溶液并存放在陰涼處避光,快速操作。

筆者所建立的含量測(cè)定方法具有良好的精密度、準(zhǔn)確性和重復(fù)性,專屬性好,可用于四味清口含片中桂皮醛和橙皮苷的含量測(cè)定,可作為該制劑的質(zhì)量控制方法。

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DOI 10.3870/yydb.2014.12.023

Determ ination of Cinnamaldehyde and Hesperidin in Siweiqing Buccal Tablets by High Performance Liquid Chromatography

ZHANG Li-zhen1,ZHOU Zhi-rong2,3
(1.The Clinic Attached to Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510240,China;2.Department ofSanitary Analysisand Sanitary Chemistry,School ofPublic Health, Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou 510310,China;3.Guangdong Key Laboratory of Molecular Epidemiology,Guangzhou 510310,China)

Objective To establish a method for the determination of hesperidin and cinnamaldehyde insiweiqingbuccal tablets.MethodsA high performance liquid chromatography(HPLC)method was established.The chromatographic conditions were as follows:the chromatographic column Inertsil ODS-SP(4.6 mm×150 mm,5μm)with the mixture of acetonitrile and water asmobile phase in gradientmode,the detection wavelength of290 nm,the flow rate of1.0 mL·min-1,the column temperature of30℃,the theoretical plate number no less than 3 000.ResultsThe linear relationship between content and peak area was obtained in the range of 0.025-0.500μg for cinnamaldehyde and 0.10-2.00μg for hesperidin.RSD of the peak area of cinnamaldehyde and hesperidin for the precision test,the stability test and the repeatability test were 1.16%and 1.03%,1.27%and 1.08%,1.23%and 1.28%,respectively.The average recovery of cinnamaldehyde was 99.24%with RSD of 1.65%(n=9).The average recovery of hesperidin was99.39%with RSD of1.85%(n=9).ConclusionThemethod can be applied to quantitative assay of cinnamaldehyde and hesperidin insiweiqingbuccal tablets with good reproducibility and specificity.The recovery resultmet the acceptance criteria.The method can effectively control the quality ofsiweiqingbuccal tablets with good specificity,reproducibility and stability,and can be applied to the quality control ofsiweiqingbuccal tablets.

Siweiqingbuccal tablets;Hesperidin;Cinnamaldehyde;Chromatography,high performance liquid;Content determination

R286;R927.2

B

1004-0781(2014)12-1627-04

2014-01-02

2014-02-01

*廣東省中醫(yī)藥局項(xiàng)目(20122109)

張麗珍(1963-),女,江西東鄉(xiāng)人,副主任中藥師,主要從事中草藥提取、分析測(cè)定研究工作。電話:020-34074636,E-mail:gzzlzhang@163.com。

周之榮(1965-),男,四川南充人,教授,碩士,研究方向:環(huán)境分析化學(xué)。電話:020-34055201,E-mail: zhouzhirong1965@sina.com。