霸王花提取物抗氧化和抗菌活性研究

李本杰，黃茂春，廖艷芳，陳 睿，* ，呂金燕

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)賽恩斯新醫(yī)藥學(xué)院，廣西南寧530222;2.廣西化工研究院，廣西南寧530001)

霸王花為仙人掌科量天尺屬植物量天尺(Hylocereus undatus(Haw.)Britt.et Rose)的花，別名劍花、量天尺，原產(chǎn)墨西哥、廣西一帶，我國主要分布于廣東、廣西、海南等地［1］。霸王花性味甘微寒，具有豐富的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，對(duì)治療肺結(jié)核、支氣管炎、頸淋巴結(jié)核、腮腺炎、腦動(dòng)脈硬化、心血管疾病有明顯療效［1－2］。王宏磊等［3］研究了霸王花水提物及其皂苷成分對(duì)DPPH自由基清除能力，結(jié)果表明霸王花具有一定的抗氧化能力。易衍等［4］從霸王花中分離并鑒定了13種黃酮醇及其苷類化合物，這些化合物被證明具有很好的抗氧化活性［5］。雖然研究中已對(duì)霸王花的水提物及其皂苷成分的DPPH抗氧化能力進(jìn)行初步的評(píng)價(jià)，但對(duì)霸王花不同溶劑提取物的其它抗氧化體系以及抗菌能力的篩選未進(jìn)行過報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)采用當(dāng)前較為普遍的清除DPPH自由基、清除ABTS自由基和鐵離子還原能力檢測3種體外抗氧化活性分析方法，對(duì)霸王花不同溶劑提取物抗氧化活性進(jìn)行了考察;并測定其對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌、大腸埃希菌、綠膿桿菌、傷寒桿菌五種菌的抑菌圈大小和最小抑菌濃度，考察霸王花各提取物的抗菌能力。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

霸王花 采于廣西德?？h，經(jīng)廣西中醫(yī)學(xué)院壯醫(yī)藥學(xué)院韋松基教授鑒定為Hylocereus undatus(Haw.)Britt.et Rose;DPPH(二苯代苦味酰自由基)，ABTS(2，2'－聯(lián)氨－雙(3－乙基苯并噻唑啉－6－磺酸)二銨鹽)購于美國Sigma Aldrich公司;BHT(2，6－二叔丁基－4－甲基苯酚)購于美國Sigma Aldrich公司;標(biāo)準(zhǔn)菌種(金黃色葡萄球菌ATCC25923;枯草芽胞桿菌ATCC6633;大腸埃希菌 ATCC35218;綠膿菌ATCC27853;傷寒桿菌ATCC10231)購于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心;其他試劑均為分析純。

Tu－1800 SPC紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;SHB－Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限責(zé)任公司;RE－52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;LDZM－40KCS立式壓力蒸汽滅菌器 上海茸研儀器有限公司;CRY－211臥式恒溫?fù)u床 上海茸研儀器有限公司。

表1 最小抑菌濃度測定實(shí)驗(yàn)Table 1 The determination test of minimum inhibitory concentration

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 部位提取 霸王花干燥花朵，粉碎后各稱取50g，用250mL 95%乙醇冷浸2d，過濾。濾渣加等量溶劑同法再提取一次，過濾，合并兩次濾液。濾液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓蒸餾，回收溶劑，殘留物低溫真空干燥至干，得霸王花乙醇提取物(EE)，得率為11.2%。同法制備丙酮提取物(AE)和乙酸乙酯提取物(EAE)，得率分別為4.23%和3.25%。

1.2.2 抗氧化能力測定

1.2.2.1 清除ABTS自由基的能力測定 參照文獻(xiàn)［6］，用去離子水將ABTS配制成7mmol/L儲(chǔ)備液，加入 K2S2O8固體，使儲(chǔ)備液中 K2S2O8濃度達(dá)到2.45mmol/L，于室溫避光放置2d備用;用0.01mol/L的PBS(pH7.4)稀釋，使其在732nm下測得吸光度在0.700±0.050范圍內(nèi);將50μL不同濃度的霸王花藥液，混合1.9mL ABTS溶液，在室溫下放置3min后測其吸光度，BHT做陽性對(duì)照。

式中，Acontrol為不加藥液的ABTS溶液的吸光度，Atest為加入藥液的ABTS溶液的吸光度。

1.2.2.2 清除DPPH自由基的能力測定 參照文獻(xiàn)［6］，取0.2mL不同濃度的霸王花提取物溶液加入8mL DPPH(0.004%)溶液中，在最大波長處(517nm)測吸光度，BHT做陽性對(duì)照。

其中，A空白為未加藥液的DPPH溶液的吸光度，A樣品為加入藥液的DPPH溶液的吸光度。

1.2.2.3 還原能力測定 參照文獻(xiàn)［7］，取0.8mL霸王花不同濃度的提取物溶液，加入2.5mL 0.01mol/L的PBS(pH7.4)溶液，2.5mL KFe(CN)4(1%);上述混合物于50℃恒溫20min后，加入2.5mL三氯乙酸溶液(10%)，離心10min;取上清液2.5mL，加入2.5mL蒸餾水，0.5mL FeCl3(1%)，混勻。在700nm處測定吸光度，以蒸餾水為參比，BHT做陽性對(duì)照。

1.2.3 提取物抗菌能力測定

1.2.3.1 培養(yǎng)基制備 MH瓊脂:MH瓊脂粉42g，溶解于1000mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15min;MH肉湯:MH肉湯粉21g，溶解于1000mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15min。

1.2.3.2 菌液制備 參照文獻(xiàn)［8］，將菌種分別于MH瓊脂平板上分區(qū)劃線，37℃培養(yǎng)24h;接種環(huán)分別挑取各菌單個(gè)菌落接種于MH肉湯中，于37℃培養(yǎng)24h;用麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)整每種菌的濃度，最終濃度為1.5 ×106CFU/mol。

1.2.3.3 濾紙片擴(kuò)散法 參照文獻(xiàn)［8］，取0.1mL的菌懸液用無菌涂布棒均勻涂布于平板培養(yǎng)基(約15mL)，將滅菌后直徑9mm的濾紙圓片在藥液(濃度250μg/mL)中浸泡20min后取出，等距離貼于平板上，每皿放4片，每菌種做3個(gè)平皿。以無菌水為空白對(duì)照，青霉素為革蘭氏陽性細(xì)菌的陽性對(duì)照，黃連素作為革蘭氏陰性菌的陽性對(duì)照。

1.2.3.4 試管法(MIC)參照文獻(xiàn)［9］，如表1，測定采用試管二倍稀釋法，取無菌試管9支，第1管加入無菌肉湯1mL作為陰性對(duì)照，第2～8管將各供試中藥液依次作二倍梯度稀釋，第9管不加藥液作為陽性對(duì)照;然后在第2～9管各加入50μL培養(yǎng)8h的供試菌液，充分搖勻后，于37℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 霸王花抗氧化能力

2.1.1 ABTS自由基清除能力 由圖1可以看出，三種提取物中，EAE表現(xiàn)出最強(qiáng)的ABTS自由基清除能力，在濃度為2mg/mL時(shí)，清除率可達(dá)80%，但仍弱于陽性對(duì)照BHT。

EE、AE、EAE、BHT 的 IC50分別為:1.82、1.89、0.79和0.62mg/mL，因此，這三種溶劑提取物和陽性對(duì)照清除ABTS自由基的能力強(qiáng)弱順序?yàn)?BHT＞EAE＞EE＞AE。

2.1.2 DPPH自由基清除能力 從圖2可看出，EAE、AE和EE對(duì)DPPH自由基均有清除作用，并且在一定劑量內(nèi)呈正量效關(guān)系，即三種提取物自由基清除能力與其濃度成正比。EAE表現(xiàn)最強(qiáng)清除能力，當(dāng)濃度為2mg/mL時(shí)，清除率可達(dá)到78.2%，但仍弱于陽性對(duì)照BHT。

EE、AE、EAE、BHT 的 IC50分別為:1.32、2.30、0.73和0.62mg/mL，因此，這三種溶劑提取物和陽性對(duì)照清除DPPH自由基的能力強(qiáng)弱順序?yàn)?:BHT＞EAE＞EE＞AE。

表2 霸王花對(duì)五種菌的抑菌效果Table 2 Five kinds of bacteria antibacterial effect of different extracts from the flowers of Hylocereus undatus

圖1 霸王花不同極性溶劑提取部位清除ABTS自由基能力Fig.1 ABTS radical scavenging activity of different extracts from the flowers of Hylocereus undatus

2.1.3 還原能力 在波長700nm條件下測定吸光度A，A越大，則樣品的還原力越大。從圖3中可以看出，隨著濃度增大，霸王花提取物的吸光度逐漸增大，這三種提取物中在濃度小于1.2mg/mL時(shí)，還原能力相差不大，EAE在濃度大于1.2mg/mL時(shí)，還原能力大于其它兩種提取物，但弱于陽性對(duì)照BHT。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:不同溶劑提取物中提取成分的不同，導(dǎo)致了抗氧化能力有所差異，其中EAE表現(xiàn)出最強(qiáng)的抗氧化能力，但弱于陽性對(duì)照BHT。

2.2 霸王花的不同極性提取物的體外抗菌活性

2.2.1 霸王花的不同極性提取物的體外抗菌活性 由表2可知，霸王花的EE對(duì)枯草芽孢桿菌有較小的抑制效果，抑菌圈大小為10mm，霸王花的AE對(duì)金黃葡萄球菌有較小的抑制效果;但是可以看到，EAE對(duì)于金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌和傷寒桿菌有一定的抑制效果，特別是其傷寒桿菌的抑菌圈大小為19mm，與作為革蘭氏陽性菌的對(duì)照品黃連素抑菌圈大小25mm非常接近。

2.2.2 霸王花的不同極性提取物最小抑菌濃度 由2.2.1的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)選取霸王花的EAE對(duì)于大腸桿菌、傷寒桿菌和綠膿桿菌的最小抑菌濃度進(jìn)行測定。

由表3可知，霸王花的EAE對(duì)大腸桿菌、傷寒桿菌和綠膿桿菌的最小抑菌濃度分別為100、12.5、200mg/mL;乙酸乙酯提取物(EAE)對(duì)傷寒桿菌有明顯抑菌效果，最小抑菌濃度為12.5mg/mL。

表3 霸王花的EAE最小抑菌濃度Table 3 The minimum inhibitory concentration of the EAE from the flowers of Hylocereus undatus

3 結(jié)論

本文采用DPPH自由基、ABTS自由基和鐵離子還原能力三種方法對(duì)霸王花提取物的體外抗氧化活性進(jìn)行研究，各提取物均表現(xiàn)出一定的抗氧化能力，其抗氧化能力的順序均為:EAE＞EE＞AE。通過與陽性對(duì)照BHT比較，結(jié)果表明，各提取物的抗氧化性均弱于BHT。此外，除枯草芽孢桿菌外，霸王花EAE對(duì)其余四種細(xì)菌具有一定的抑制作用，尤其對(duì)傷寒桿菌作用效果明顯，其最小抑菌濃度為12.5mg/mL。綜合上述結(jié)果可得出霸王花乙酸乙酯提取部分的抗氧化及抑菌活性最好，具有作為天然抗氧化劑和天然抗菌素研究和開發(fā)的潛力。

［1］國家中醫(yī)藥管理局中華本草編委會(huì).中華本草［M］.第六卷.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，2004:865.

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