蘋果汁和桃汁種類特異性PCR檢測(cè)方法的研究

孫建霞，白衛(wèi)濱 ，曹春廷，張振華，邱瑞霞，吳希陽(yáng)，歐仕益

(1.廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院，廣東廣州510090;2.暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東廣州510632)

DNA分子檢測(cè)方法是從基因水平鑒別品種的一種手段，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增種類特異性基因進(jìn)行成分鑒定，可以不受時(shí)間和環(huán)境影響，又能從基因水平直接反映不同種類間差異，是快速可行、高效準(zhǔn)確的方法。在PCR技術(shù)誕生的20多年里，隨著分子生物學(xué)研究的不斷深入和發(fā)展，分子生物學(xué)手段為各種水果的遺傳研究和育種工作提供了有利工具。研究者在對(duì)水果的遺傳特性研究基礎(chǔ)上，建立了各種水果的基因庫(kù)，但卻很少應(yīng)用于果汁分子水平種類鑒定。蘋果汁主要的摻假現(xiàn)象有三種，即廉價(jià)果汁摻假，糖類及水的摻假和調(diào)配蘋果汁摻假［1］。目前，大多數(shù)鑒別摻假果汁的方法均為對(duì)各種水果特有的標(biāo)志性化合物檢測(cè)。Versari等［2］將蘋果汁中酮類物質(zhì)作為標(biāo)志性化合物用反相高效液相色譜法進(jìn)行摻假檢測(cè)。劉溫喜［3］針對(duì)蘋果汁中的多酚類物質(zhì)和D，L-蘋果酸用超高效液相色譜法鑒別摻假的濃縮蘋果汁。胡耀星等［4-5］分別從糖、有機(jī)酸、氨基酸、穩(wěn)定性同位素、類黃酮、陽(yáng)離子及光譜學(xué)等方面采用不同檢測(cè)方法對(duì)蘋果汁的摻假進(jìn)行了檢測(cè)。同時(shí)，Kuchemnko等［6］用電壓諧振器對(duì)蘋果芳香組成的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行摻假檢測(cè)。Wald B等［7］將存在于用梨汁摻假的蘋果汁而不存在于純蘋果汁的異鼠李素葡萄糖苷作為標(biāo)志性化合物。Muntean［8］首次同時(shí)使用碳水化合物色譜和離子色譜分離蘋果汁中4種主要的碳水化合物和6種陽(yáng)離子來(lái)檢測(cè)果汁的摻假。Lukas等［9］根據(jù)橘汁中代謝組指紋來(lái)檢測(cè)橘汁中摻假的蘋果汁和葡萄柚汁。然而，果汁中所含有的標(biāo)志化合物是不恒定的，外界環(huán)境和加工條件都會(huì)影響其含量，因此，用理化方法對(duì)果汁進(jìn)行鑒偽具有局限性。隨著無(wú)損檢測(cè)的興起，也有不少人將紅外光譜法應(yīng)用于果汁摻假檢測(cè)。Lorenzo等［10-11］用紅外光譜法對(duì)摻雜各種糖類物質(zhì)的蘋果汁單一建模來(lái)檢測(cè)。而Luis等［12］用紅外光譜對(duì)蘋果汁中的碳水化合物建模來(lái)檢測(cè)糖類物質(zhì)的摻假。高志明等［13］對(duì)蘋果汁摻假梨汁用紅外光譜法檢測(cè)。紅外光譜法雖然具有快速無(wú)損等特點(diǎn)，但是其數(shù)據(jù)模型制作麻煩且只能針對(duì)一種摻假物質(zhì)檢測(cè)。分子生物學(xué)技術(shù)在果汁鑒偽方面的應(yīng)用不多，Chang等［14］用分子生物學(xué)方法鑒定鮮榨和還原橙汁。韓建勛等［15］實(shí)時(shí)熒光PCR對(duì)常見(jiàn)果汁中梨摻假現(xiàn)象檢測(cè)，但此研究并未涵蓋除梨汁以外其他果汁的摻假。

表2 蘋果和桃特異性引物Table 2 Specific primers of apple and peach

本研究通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選蘋果和桃特異性基因，進(jìn)而根據(jù)該特異性基因確定特異性擴(kuò)增引物，使其能在基因水平上反映水果種類的差異，并應(yīng)用于蘋果汁和桃汁的鑒偽研究，該方法不受其他遺傳效應(yīng)和環(huán)境條件的影響，具有在蘋果和桃深加工產(chǎn)品中區(qū)分成分的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘋果和桃 均購(gòu)于超市，4℃保存，樹(shù)種與品種見(jiàn)表1;梨、柑橘、番木瓜、櫻桃和草莓等 由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院饋贈(zèng);rTaq酶、dNTPs、PCR緩沖液、溴化乙錠、分子量Marker(100～2000bp) 大連寶生物公司;CTAB、SDS、PVP、β-巰基乙醇、EDTA、Tris飽和苯酚 Sigma公司;其余化學(xué)試劑 北京分析儀器廠。

表1 實(shí)驗(yàn)材料Table 1 Test material

微量移液器 德國(guó)Eppendorf公司;ABI 2720 thermal cycler(Applied Biosystems)PCR擴(kuò)增儀 美國(guó)ABI公司;D640核酸蛋白分析儀 美國(guó)Beckman公司;Gel Doc1000凝膠成相系統(tǒng) 美國(guó)Bio Rad公司;5804R型低溫高速離心機(jī) Ependoff公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 改良CTAB法提取DNA 果肉DNA的提取。取經(jīng)液氮磨碎的蘋果、桃、梨、柑橘、番木瓜、櫻桃和草莓 200mg，各加入 2mL離心管中;加入 1000μL CTAB溶液，振蕩均勻，65℃溫育40min，1200r/min離心10min，吸取上清;加入等體積酚:三氯甲烷:異戊醇(25∶24∶1)，振蕩均勻，1200r/min 離心 10min。吸取上清液，加入另一新管中，再加入等體積酚:三氯甲烷:異戊醇(25∶24∶1)，振蕩均勻，1200r/min 離心10min;吸取上清加入等體積三氯甲烷:異戊醇(24∶1)，吸取上清;加入2/3體積的異丙醇，-80℃沉淀20min或-20℃沉淀2h，1200r/min離心10min;棄去上清液，加入70%乙醇溶液洗滌，12000r/min離心2min。棄去上清液，干燥，用50μL TE溶液溶解沉淀;加入2μL RNA酶溶液，37℃溫育30min;-20℃保存，備用。蘋果汁和桃汁DNA的提取。取鮮榨果汁1mL，分別取1mL 100%各加入10mL離心管;加入4mL CTAB(加3.3%聚乙烯吡咯酮(K30)PVP)溶液，其余步驟與上同。

1.2.2 蘋果和桃保守序列的確定 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)公布的基因序列，查找蘋果屬和桃屬特異性的基因，通過(guò)篩選得到蘋果屬抑制蛋白的mal d 4.02基因(登錄號(hào)FM887031.1)，桃屬微衛(wèi)星標(biāo)記MA023a(登錄號(hào)AB077132.1)，通過(guò)BLAST比較具有品種特異性，同時(shí)以植物高度保守的葉綠體AccD基因(登錄號(hào)EU326013.1)作為內(nèi)標(biāo)。

1.2.3 蘋果和桃特異性引物的設(shè)計(jì)與篩選 據(jù)NCBI的引物在線設(shè)計(jì)軟件結(jié)合BLAST比對(duì)，通過(guò)PCR擴(kuò)增驗(yàn)證篩選獲得蘋果、桃特異性引物如表2所示。為了驗(yàn)證蘋果和桃的定性PCR體系的特異性，同時(shí)以富士、紅星、小國(guó)光、肥桃、水蜜桃、寒露桃、鴨梨、雪花梨、黃金梨、蜜桔、紅桔、沙糖桔、番木瓜、櫻桃、草莓基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。

1.2.4 特異性引物的PCR擴(kuò)增條件 擴(kuò)增采用反應(yīng)體系為 30μL，含 1×PCR 緩沖液(50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-HCl，pH8.3，1.5mmol/LMgCl2)，0.2mmol/L dNTPmix，0.3μmol/L 引 物 GT1F 和GT1R，2.5 U Taq DNA聚合酶，100ng基因組 DNA。擴(kuò)增程序?yàn)?預(yù)變性(5min/94℃);40循環(huán):變性(30sec/94℃)，退火(30s/58℃)延伸(30s/72℃);延伸(5min/72℃)。反應(yīng)結(jié)束后取5μL PCR產(chǎn)物于2%的瓊脂糖凝膠，1×TAE緩沖液中，穩(wěn)壓90V電泳30min，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下檢測(cè)。

1.2.5 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序 蘋果和桃PCR擴(kuò)增特異性產(chǎn)物送上海生工(北京)測(cè)序。

1.2.6 特異性引物的PCR擴(kuò)增靈敏度分析 分別以富士蘋果、水蜜桃的DNA為模板，按照100、50、25、10、5、2.5、0ng/μL 的模板添加量，參照 1.2.4 的反應(yīng)體系和最佳退火溫度進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果在2%的瓊脂糖凝膠中檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果和桃引物種類特異性的定性檢測(cè)

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)篩選設(shè)計(jì)的特異性的引物，優(yōu)化PCR條件，建立蘋果、桃種類特異性的定性檢測(cè)體系，同時(shí)驗(yàn)證體系的特異性和靈敏度。

結(jié)果顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物為242bp的ACC內(nèi)源參照基因在所有擴(kuò)增模板的體系中均有預(yù)期條帶出現(xiàn)(圖1)。這說(shuō)明PCR體系沒(méi)有受到抑制。大小為129bp的擴(kuò)增條帶，僅在以富士、紅星、小國(guó)光為模板的時(shí)候出現(xiàn);大小為179bp的擴(kuò)增條帶，僅在以肥桃、水蜜桃、寒露桃為模板的時(shí)候出現(xiàn);而以其它非種類特異性水果為模板時(shí)，沒(méi)有出現(xiàn)相應(yīng)的擴(kuò)增條帶(圖2，圖3)。

圖1 通用內(nèi)標(biāo)基因ACC擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification results of the endogenous gene ACC

由圖1～圖3可知，蘋果和桃種特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物生工測(cè)序結(jié)果與理論序列一致，表明結(jié)果的可靠性。

2.2 蘋果、桃、梨、柑橘種類特異性的PCR引物靈敏度

為了驗(yàn)證該蘋果、桃、梨、柑橘的種類特異性引物的 PCR 靈敏性，分別稀釋成 100、50、25、10、5、2.5、0ng/μL的模板DNA，以這些DNA樣品為模板進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果如圖4、圖5所示。

結(jié)果表明蘋果、桃屬特異性引物的最低檢測(cè)限分別為5、10ng/μL。

圖2 蘋果屬特異性引物定性檢測(cè)結(jié)果Fig.2 The qualitative detection results of malues-specific primers

圖3 桃屬特異性引物定性檢測(cè)結(jié)果Fig.3 The qualitative detection results of amygdalus-specific primers

圖4 蘋果屬特異性引物定性檢測(cè)的靈敏度Fig.4 The qualitative detection sensitivity of malues-specific primers

通過(guò)驗(yàn)證定性檢測(cè)體系的特異性和靈敏性，說(shuō)明蘋果、桃屬特異性引物在分子水平鑒定蘋果、桃是可行的。這將為今后這兩種水果的深加工產(chǎn)品提供技術(shù)支持。

2.3 蘋果和桃鮮榨汁的應(yīng)用檢測(cè)

通過(guò)優(yōu)化改進(jìn)的CTAB法提取的鮮榨汁的基因組DNA，進(jìn)行ACC內(nèi)標(biāo)基因、蘋果汁和桃汁種類特異性基因的擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)表3。

圖5 桃屬特異性引物定性檢測(cè)的靈敏度Fig.5 The qualitative detection sensitivity of amygdalus-specific primers

從表3的擴(kuò)增結(jié)果可以看出，7種鮮榨果汁僅僅富士蘋果汁和水蜜桃汁的相對(duì)應(yīng)種屬特異性陽(yáng)性擴(kuò)增。表明此方法可以很好的應(yīng)用于蘋果汁和桃汁的種屬特異性檢測(cè)。

表3 蘋果和桃鮮榨汁的種類特異性基因的擴(kuò)增結(jié)果Table 3 Amplification results of the apple and peach fresh juice species-specific gene

3 結(jié)論與討論

普通PCR方法是目前分子檢測(cè)的最主要手段之一。它具有快速、高效、準(zhǔn)確、靈敏、操作簡(jiǎn)單、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，適用于開(kāi)展水果種類特異性的鑒定。本研究以ACC基因?yàn)橥ㄓ脙?nèi)標(biāo)，建立了蘋果、桃屬種類特異性鑒定方法，并通過(guò)引物特異性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了該方法準(zhǔn)確性。內(nèi)標(biāo)基因的設(shè)定，排除了由于DNA質(zhì)量以及實(shí)驗(yàn)操作等因素對(duì)檢測(cè)結(jié)果可靠性的影響，避免了假陰性結(jié)果的發(fā)生。

通過(guò)蘋果、桃屬特異性引物的PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化，兩種水果引物的特異性PCR擴(kuò)增和PCR靈敏度分析表明，蘋果、桃屬特異性引物除對(duì)各自屬擴(kuò)增出目的性條帶外，對(duì)其它屬均沒(méi)有條帶擴(kuò)增，特異性引物的靈敏度均較高。因此，蘋果、桃屬種類特異性檢測(cè)方法具有穩(wěn)定性好、特異性強(qiáng)和靈敏度高的特點(diǎn)，適用于蘋果、桃屬種類鑒定并成功應(yīng)用于蘋果汁和桃汁的種屬鑒定，具有重要應(yīng)用價(jià)值。然而此方法僅能用來(lái)定性檢測(cè)一大類物質(zhì)，但對(duì)種屬內(nèi)的不同品種產(chǎn)品不能區(qū)分，而且也不能進(jìn)行定量測(cè)定，因此，下一步需建立蘋果汁和桃汁的定量檢測(cè)方法研究。

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