毛細(xì)管區(qū)帶電泳－間接紫外法快速測定食品中的甜蜜素

陳 桐， 丁曉靜， 李一正， 趙旭東， 趙 珊

（1.首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，北京100069；2.北京市疾病預(yù)防控制中心，食物中毒診斷溯源技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100013；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院，北京100029；4.首都師范大學(xué)化學(xué)系，北京100089）

甜蜜素又稱環(huán)己基氨基磺酸鈉，因其口感好且價(jià)格低廉而成為我國食品行業(yè)中應(yīng)用最多的甜味劑之一［1］。然而其代謝產(chǎn)物環(huán)己胺對(duì)心血管系統(tǒng)和睪丸有毒性［2］、對(duì)腎功能也有一定的損害等副作用［3］，過量甜蜜素還會(huì)對(duì)飲用水造成污染［4］。因此，美國、英國、日本和東南亞等禁止其作為食品添加劑使用［5］。我國于1987年批準(zhǔn)使用，主要用于蜜餞、醬菜、糕點(diǎn)、炒貨等，但有嚴(yán)格的限量要求，如飲料類最大使用量為0.65 g／kg，蜜餞類為1.0 g／kg，話梅、陳皮等為8.0 g／kg［6］。但甜蜜素違規(guī)添加的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生［7］，為保護(hù)消費(fèi)者健康，有必要建立簡單、快速的食品中甜蜜素的測定方法。

目前基于分離技術(shù)測定甜蜜素的方法有高效液相色譜法（HPLC）［8－10］、高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC－MS／MS）［7，11－14］、氣相色譜法（GC）［15，16］、離子色譜 法 （IC）［17－19］及 毛 細(xì) 管 電 泳 （CE）法［3，20－22］等。其中HPLC需消耗大量有機(jī)溶劑。HPLCMS／MS對(duì)樣品前處理要求較高，經(jīng)常需固相萃取凈化后才能進(jìn)樣，無疑增加了檢測成本。而國家標(biāo)準(zhǔn)GC法測定前需進(jìn)行亞硝化衍生，易出現(xiàn)假陽性［1］，而且樣品前處理所需時(shí)間長，所用試劑毒性也比較大［17］，難以滿足大批量樣品快速檢測的需求。盡管改進(jìn)的樣品前處理方法不斷推出，但前處理仍需大量有機(jī)溶劑且時(shí)間仍較長［23，24］。IC需使用較昂貴的色譜柱，且大部分IC色譜柱不耐有機(jī)溶劑，故不能像HPLC色譜柱那樣可以用有機(jī)溶劑清洗，實(shí)際樣品分析后易出現(xiàn)柱效下降現(xiàn)象而產(chǎn)生較高的分析成本。CE因較高的分離效率而對(duì)樣品的前處理要求不高，飲料樣品可直接進(jìn)樣測定［3］，固體樣品僅需溶解后即可測定［21］，適合于各種食品樣品的分析［25］。本研究在文獻(xiàn)［22］基礎(chǔ)上，采用了全新的分離緩沖體系及檢測波長，使方法更耐用、靈敏。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

苯甲酸鈉（分析純）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；碳酸鈉及氫氧化鈉（優(yōu)級(jí)純）購自北京化學(xué)試劑公司；十六烷基三甲基溴化銨（CTAB，≥99%）購自美國Sigma－Aldrich公司；甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)品（99%）購自比利時(shí)Acros Organics公司；內(nèi)徑75μm未涂敷石英毛細(xì)管購自河北永年銳灃色譜配件有限公司；甜蜜素能力驗(yàn)證樣品由沈陽產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院提供；其余樣品（酸梅湯、蘋果醋、果脯（陳皮、藍(lán)莓、無花果、烏梅）及醬菜小蘿卜）均購自本地超市。

1.2 儀器與設(shè)備

P／ACE MDQ型毛細(xì)管電泳儀配二極管陣列檢測器（美國Beckman公司）；Millipore Milli－Elix／RiOs型超純水器（美國 Millipore公司）；F50A型酸度計(jì)（北京屹源電子儀器科技公司）；Universal 32高速離心機(jī)（德國Hettich公司）；渦旋振蕩器（英國Bibby Sterilin有限公司）；A11B S25型均質(zhì)儀（德國IKA公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

稱取100 mg甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用超純水溶解后稀釋，定容至10 mL，配成質(zhì)量濃度為10 g／L 的甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，轉(zhuǎn)移至10 mL塑料離心管中備用。

1.3.2 樣品預(yù)處理

液體樣品用超純水稀釋后直接進(jìn)樣。固體樣品先用均質(zhì)儀粉碎或用剪刀剪碎，稱取0.2 g于10 mL塑料離心管中，加5 mL超純水，超聲提取10 min，9 000 r／min下離心5 min，根據(jù)樣品中甜蜜素的含量，將上清液直接進(jìn)樣或用超純水稀釋后進(jìn)樣。

1.3.3 毛細(xì)管的預(yù)處理

新的毛細(xì)管用1 mol／L NaOH沖洗20 min，水沖洗5 min及分離緩沖液沖洗5 min。每次進(jìn)樣前用1 mol／L NaOH、水及分離緩沖液洗2 min，以保證方法的重現(xiàn)性。

1.3.4 電泳條件

毛細(xì)管：80 cm×75μm （有效長度70 cm）；分離緩沖液：2 mmol／L 苯甲酸鈉＋10 mmol／L 碳酸鈉＋0.5 mmol／L CTAB；分離電壓：－30 kV；檢測波長：200 nm；樣品室溫度：25℃；進(jìn)樣壓力及時(shí)間：3 448 Pa，18 s；工作電流：約38μA。

2 結(jié)果與討論

2.1 探針和檢測波長的選擇

甜蜜素沒有特征紫外吸收，本實(shí)驗(yàn)采用間接紫外法進(jìn)行測定。通常將有紫外吸收的物質(zhì)（探針）加到分離緩沖液中，當(dāng)無紫外吸收的待測物質(zhì)通過檢測器時(shí)，分離緩沖液的紫外吸收下降，而產(chǎn)生待測物的倒峰［26］，通過儀器的工作站軟件將倒峰轉(zhuǎn)為正峰。一般使用200 nm或205 nm附近的檢測波長，以獲得絕大多數(shù)物質(zhì)的高靈敏度檢出［27］。

間接紫外法中探針的選擇原則是［28］：探針的淌度與待分析離子的淌度越匹配越好，否則待分析離子的峰形不好或靈敏度不高。本研究在文獻(xiàn)［22］基礎(chǔ)上分別考察了苯甲酸鈉和山梨酸鉀為探針時(shí)甜蜜素的檢測靈敏度。

苯甲酸鈉的最大紫外吸收波長為220 nm，文獻(xiàn)［22］選用254 nm作為檢測波長，本實(shí)驗(yàn)比較了分別在200、220及254 nm檢測時(shí)甜蜜素的靈敏度，如圖1所示。發(fā)現(xiàn)200 nm檢測的靈敏度最高，故以苯甲酸鈉為探針時(shí)200 nm為最佳檢測波長。

圖1 苯甲酸鈉為探針時(shí)20 mmol／L 甜蜜素在不同檢測波長下的電泳圖Fig.1 Electropherograms of 20 mmol／L cyclamate at different detection wavelengths using sodium benzoate as probeDetection wavelengths：a.254 nm；b.220 nm；c.200 nm.Capillary：80 cm×75μm（effective length：70 cm）；separation buffer：2 mmol／L sodium benzoate，10 mmol／L sodium carbonate and 0.5 mmol／L hexadecyl trimethyl ammonium bromide；sample extraction solution：pure water；separation voltage：－30 kV；injection pressure and time：3448 Pa×18 s.1.cyclamate.

山梨酸鉀的最大紫外吸收波長為251 nm。以山梨酸鉀為探針，比較了甜蜜素在200、214及251 nm檢測時(shí)的靈敏度。發(fā)現(xiàn)隨著檢測波長的增加，靈敏度也越來越高，故以山梨酸鉀為探針時(shí)251 nm為最佳檢測波長。

保持分離緩沖液中其余組分及濃度不變，比較了2 mmol／L 山梨酸鉀（檢測波長：251 nm）和苯甲酸鈉（檢測波長：200 nm）作為探針時(shí)甜蜜素的峰高及峰形。結(jié)果表明：甜蜜素在兩種探針體系中的峰高相當(dāng)，但在山梨酸鉀探針體系中的峰形比苯甲酸鈉體系中的寬，故本研究選用苯甲酸鈉為探針，且檢測波長為200 nm。

2.2 探針濃度的選擇

探針濃度過低將因電遷移擴(kuò)散而導(dǎo)致待測物的峰展寬，而探針的濃度過高將影響檢測器的線性范圍并增加基線噪聲，故一般選擇探針濃度2～20 mmol／L［29］。保持分離緩沖液中其他組分的濃度不變，苯甲酸鈉的濃度從2 mmol／L 至20 mmol／L增大時(shí)，甜蜜素的峰遷移時(shí)間逐漸增加，且靈敏度越來越低（見圖2），故苯甲酸鈉的最佳濃度為2 mmol／L。

圖2 苯甲酸鈉濃度對(duì)甜蜜素測定的影響Fig.2 Effects of the concentration of sodium benzoate on determination of cyclamateConcentrations of sodium benzoate：a.2 mmol／L；b.6 mmol／L；c.10 mmol／L；d.20 mmol／L.Other CZE conditions are the same as in Fig.1.1.cyclamate；other peaks：unknown.

2.3 分離緩沖體系及其濃度的選擇

苯甲酸的p Ka＝4.20，氫氧化銨的p Ka＝9.26。文獻(xiàn)［22］用10 mmol／L 苯甲酸鈉與1 mmol／L 十六烷基三甲基氫氧化銨（pH6.6）作為分離的背景電解質(zhì)，所用pH6.6既不在苯甲酸鈉的緩沖范圍（pH3.2～5.2）之內(nèi)，也不在氫氧化銨的緩沖范圍（pH8.26～10.26）之內(nèi)。不具備緩沖能力的背景電解質(zhì)使得甜蜜素的遷移時(shí)間重現(xiàn)性不好，故作者以α－羥基異丁酸為內(nèi)標(biāo)，盡管增加了定量的重現(xiàn)性，但實(shí)際操作麻煩。

硼砂因紫外吸收低而成為CE中常用無機(jī)緩沖鹽。實(shí)驗(yàn)初期，向2 mmol／L 苯甲酸鈉及0.5 mmol／L CTAB背景電解質(zhì)中加入10 mmol／L 硼砂。盡管甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰形很好，但在實(shí)際樣品分析中不能實(shí)現(xiàn)甜蜜素與基體中雜質(zhì)峰的分離。用1 mol／L NaOH調(diào)節(jié)pH后，甜蜜素的峰與雜質(zhì)峰有分離的趨勢，且隨著NaOH濃度的增加，分離也越來越好。當(dāng) NaOH濃度增至20 mmol／L，且加入1 g／L的高分子添加劑PEG 35000后，甜蜜素與雜質(zhì)峰達(dá)基線分離。此時(shí)分離緩沖液pH為10.28，顯然超出了硼砂體系的緩沖范圍（8.24～10.24）。盡管超出的不多，而且也得到較好的重現(xiàn)性，但為進(jìn)一步增加分析方法的重現(xiàn)性，用碳酸鈉代替硼砂。碳酸的p Ka2＝10.25，碳酸鹽的pH緩沖范圍為9.25～11.25。無需調(diào)節(jié)pH，也無需添加高分子添加劑PEG 35000，僅需易于準(zhǔn)確配制的3種組分（探針、電滲流反向劑及無機(jī)緩沖鹽）組成的分離緩沖體系，即可實(shí)現(xiàn)實(shí)際樣品中甜蜜素與雜質(zhì)峰間的分離。

為避免基體干擾，本研究除檢測波長的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中使用標(biāo)準(zhǔn)溶液外，其余條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)均選用蘋果醋樣品進(jìn)行優(yōu)化。間接紫外法需選用低濃度鹽作為緩沖溶液，濃度通?？刂圃?～10 mmol／L 之間［27］。保持其他組分的濃度不變，分別考察了5、10及15 mmol／L碳酸鈉對(duì)甜蜜素測定的影響。隨著碳酸鈉濃度的增加，電滲流降低，甜蜜素的遷移時(shí)間增加，焦耳熱增加而導(dǎo)致甜蜜素的靈敏度下降且峰展寬，故碳酸鈉的最佳濃度選為10 mmol／L，如圖3所示。

圖3 碳酸鈉濃度對(duì)甜蜜素測定的影響Fig.3 Effect of the concentration of sodium carbonate on the determination of cyclamateConcentrations of sodium carbonate：a.5 mmol／L；b.10 mmol／L；c.15 mmol／L.Other CZE conditions are the same as in Fig.1.1.cyclamate；other peaks：unknown.

2.4 分離緩沖液中電滲流反向劑的選擇

甜蜜素在堿性分離緩沖液中帶負(fù)電，從而向陽極遷移而不能遷移至陰極的檢測窗口，故需加入電滲流反向劑CTAB，以保證帶負(fù)電的甜蜜素遷移方向與電滲流方向一致并能夠遷移到檢測窗口而被檢測，從而縮短分析時(shí)間。0.5 mmol／L CTAB足以保證電滲流反向并獲得穩(wěn)定的電滲流［30］，故本研究選擇向分離緩沖液中添加0.5 mmol／L CTAB。

2.5 毛細(xì)管內(nèi)徑、長度及進(jìn)樣時(shí)間的選擇

無論從檢測靈敏度還是分離度方面考慮，內(nèi)徑50μm的石英毛細(xì)管最為常用，故實(shí)驗(yàn)初期選用60.2 cm×50μm（有效長度：50 cm）的毛細(xì)管，進(jìn)樣時(shí)間為10s，甜蜜素的檢出限為55.6 mg／kg。為進(jìn)一步增加檢測靈敏度，改用75μm內(nèi)徑的毛細(xì)管，但為了避免因內(nèi)徑增加而導(dǎo)致的分離柱效下降，增加管長至80 cm（有效長度：70 cm）。這樣做的好處是在盡量不降低柱效的同時(shí)還可以增加進(jìn)樣量，從而進(jìn)一步增加檢測靈敏度，而靈敏度的增加意味著將實(shí)際樣品稀釋更多的倍數(shù)后仍能夠檢測到其中的甜蜜素，同時(shí)還可通過多倍數(shù)稀釋消除基體干擾，避免基體對(duì)毛細(xì)管的污染，這也是本研究能夠分析食品中甜蜜素的關(guān)鍵所在。

優(yōu)化進(jìn)樣時(shí)間（10、15、18、20及25 s），結(jié)果表明隨著進(jìn)樣時(shí)間的增加，靈敏度越來越高，然而峰也越來越寬，故本研究選用進(jìn)樣時(shí)間為18 s。

2.6 分離電壓的選擇

升高電壓可縮短分析時(shí)間，但過高的電壓可使電流增加，產(chǎn)生過量的焦耳熱。這些熱量不能及時(shí)散失，使徑向溫度梯度加大，導(dǎo)致區(qū)帶展寬，反而會(huì)使分離效率和靈敏度下降。但本實(shí)驗(yàn)采用的無機(jī)鹽緩沖液濃度不高，僅為10 mmol／L Na2CO3，電壓從20、25及28 kV增加至30 kV時(shí)仍未觀察到峰展寬?？紤]到分離時(shí)間，選擇－30 kV為分離電壓。

2.7 樣品前處理?xiàng)l件的選擇

甜蜜素的水溶性好，可通過簡單的用水稀釋的方式將樣品電導(dǎo)值降至低于分離緩沖液的電導(dǎo)值，以利于樣品堆積而進(jìn)一步增加檢測靈敏度，基體干擾被消除的同時(shí)仍能夠檢測到其中的甜蜜素。與目前的國家標(biāo)準(zhǔn)GC方法［15］相比，極大地減少了樣品前處理時(shí)間，提高了樣品分析的通量。

2.8 工作曲線、線性范圍、檢出限和精密度

將甜蜜素的儲(chǔ)備液用水逐級(jí)稀釋成1.2、2.5、5、10、20、40及80 mg／L 標(biāo)準(zhǔn)工作液，在上述優(yōu)化的電泳條件下依次進(jìn)樣分析，校正峰面積外標(biāo)法定量。校正峰面積（A）與質(zhì)量濃度（x，mg／L）間呈良好線性關(guān)系，線性回歸方程A＝286.55x＋45.799，相關(guān)系數(shù)r＝0.999 9，線性范圍1.2～80 mg／L，檢出限8.9 mg／kg（S／N＝3），定量限26.7 mg／kg（S／N＝9）。

將2.5、10及20 mg／L 甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液分別連續(xù)進(jìn)樣7次，以考察儀器精密度。得到遷移時(shí)間的RSD分別為0.1%、0.1%及0.07%；校正峰面積的RSD分別為6.4%、3.9%及2.0%。按1.3.2節(jié)中的方法平行處理7份樣品后進(jìn)樣測定，以考察方法的日內(nèi)精密度，測定結(jié)果的RSD為2.6%。每天平行測定兩份樣品，連續(xù)測定7天，以考察方法的日間精密度，測定結(jié)果的RSD為4.5%。

2.9 回收率試驗(yàn)

以市售不含甜蜜素的樣品為空白樣品，按1.3.2節(jié)前處理方法，分別在2.5、10及20 mg／L這3個(gè)水平進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，電泳圖見圖4。每個(gè)加標(biāo)水平平行處理5份樣品進(jìn)行測定，結(jié)果見表1。

圖4 空白樣品加標(biāo)的電泳圖Fig.4 Electropherograms of spiked blank samplesa.blank sample；b.blank sample spiked with 10 mg／L cyclamate；c.10 mg／L cyclamate standard.CZE conditions are the same as in Fig.1.1.cyclamate.

表1 方法的加標(biāo)回收率結(jié)果（n＝5）Table 1 Results of the recovery test（n＝5）

2.10 樣品分析

利用所建立的方法測定了甜蜜素能力驗(yàn)證樣品，結(jié)果為0.094 g／kg（以環(huán)己基氨基磺酸計(jì)），Z比分值＝－0.8，與國家標(biāo)準(zhǔn) GC 法［15］所測結(jié)果（0.098 g／kg）相吻合，進(jìn)一步證實(shí)了本方法的準(zhǔn)確性。在此基礎(chǔ)上對(duì)7件食品樣品進(jìn)行了分析，結(jié)果見表2，未發(fā)現(xiàn)超標(biāo)樣品。其中無花果果脯樣品的電泳圖見圖5。

表2 食品中甜蜜素的測定結(jié)果（n＝5）Table 2 Contents of cyclamate in food samples（n＝5）

圖5 無花果果脯樣品的電泳圖Fig.5 Electropherogram of fig fruit sampleCZE conditions are the same as in Fig.1.1.cyclamate.

3 結(jié)論

采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳－間接紫外法，利用簡單的無機(jī)鹽分離緩沖體系，11 min（預(yù)清洗6 min；分離5 min）內(nèi)即可完成甜蜜素的分離與測定。樣品前處理簡單，無需衍生，僅需用水提取，極大地降低了檢測成本，提高了實(shí)際樣品的分析速度，并獲得可與國家標(biāo)準(zhǔn)方法相媲美的準(zhǔn)確定量結(jié)果。然而與國家標(biāo)準(zhǔn)方法形成鮮明對(duì)比的是，整個(gè)分析過程無需有機(jī)溶劑，適合于大量常規(guī)樣品的高通量分析。

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