在線凈化液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定牛奶中的6種孕激素

段永生， 王炳玲， 艾連峰＊， 郭春海， 葛世輝， 張婧雯， 徐牛生

（1.河北出入境檢驗(yàn)檢疫局，河北 石家莊050051；2.賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司，上海201206）

孕激素是維持妊娠所需要的二十一碳類固醇激素，包括天然化合物和人工合成化合物。這些物質(zhì)一般都較穩(wěn)定，不易降解，在人體內(nèi)具有一定的生物活性，長(zhǎng)期食用含孕激素的食品會(huì)嚴(yán)重影響人體的正常生理功能，更嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致人體突變，具致畸形、致癌的潛在危害［1］；已有研究表明，兒童性早熟、婦女乳腺癌和子宮癌發(fā)病率的上升與動(dòng)物源性食品中性激素殘留有關(guān)。我國(guó)農(nóng)業(yè)部176號(hào)公告明確規(guī)定，禁止飼料和動(dòng)物飲用水中添加炔諾醇、左炔諾孕酮、炔諾酮等孕激素，并在235號(hào)公告規(guī)定了醋酸甲羥孕酮等外源性激素物質(zhì)在動(dòng)物性食品中的最高殘留限量為不得檢出。但迫于利益驅(qū)使，為提高奶牛產(chǎn)奶量，仍有養(yǎng)殖戶非法使用孕激素，嚴(yán)重影響了人們的身體健康和我國(guó)的出口貿(mào)易。

目前，對(duì)于孕激素類藥物殘留的檢測(cè)方法已有很多，用于食品中激素殘留檢測(cè)的方法主要有氣相色譜－質(zhì)譜法（GC－MS）［2，3］和液相色譜－質(zhì)譜法（LCMS）［4－11］。但其殘留檢測(cè)的前處理方法步驟較為繁瑣，多需要經(jīng)酶解或固相萃取，新的QuEChERS技術(shù)也需要旋蒸濃縮等步驟［12，13］，實(shí)驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)、耗材消耗量大，且前處理中大量有害試劑對(duì)操作人員可能有危害風(fēng)險(xiǎn)。

TurboFlow在線凈化技術(shù)結(jié)合了擴(kuò)散、化學(xué)和體積排除的原理，在捕獲感興趣分析物的同時(shí)，快速凈化樣品；結(jié)合高靈敏度、高定性能力的串聯(lián)質(zhì)譜保證了方法的靈敏度，該技術(shù)已應(yīng)用于食品中化學(xué)污染物的分析［14－17］。本文采用該技術(shù)建立了在線凈化液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定牛奶中炔諾酮、17α－羥基孕酮、甲羥孕酮、乙酸甲地孕酮、孕酮和醋酸美倫孕酮6種孕激素類藥物殘留的方法，為牛奶中孕激素的多殘留分析提供了一個(gè)快速而有效的“綠色”解決方案。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

TurboFlow在線凈化液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo Fisher公司），由CTC多功能自動(dòng)進(jìn)樣器（配有100μL定量環(huán)）、兩個(gè)耐壓125 MPa的四元梯度液相泵、六通閥切換裝置、多元柱切換裝置和TSQ Quantum Ultra三重四極桿質(zhì)譜儀組成；PT2100型均質(zhì)器（瑞士Kinematica公司）；高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Sigma 4K－18）；漩渦振蕩器（美國(guó)Vortex－Genie2）；超聲波清洗器（KQ－500E）。甲醇、乙腈均為色譜純；水為Milli－Q高純水。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：炔諾酮、17α－羥基孕酮、甲羥孕酮、乙酸甲地孕酮、孕酮、醋酸美倫孕酮，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司，純度≥99%。內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：炔諾酮－D6、孕酮－D9，純度≥99%。

精確稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈配制成100 mg／L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用乙腈配制成質(zhì)量濃度為1 mg／L 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液；分別取內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用乙腈配制成質(zhì)量濃度為1 mg／L 的混合內(nèi)標(biāo)工作液。用混合標(biāo)準(zhǔn)工作液和內(nèi)標(biāo)工作液配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，孕激素質(zhì)量濃度范圍在0.1～50μg／L 范圍內(nèi)，內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為5μg／L。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理

準(zhǔn)確稱取樣品約2 g（精確到0.01 g），置于50 mL離心管中，加入50μL混合內(nèi)標(biāo)工作液和10 mL乙腈，渦旋提取 0.5 min，超聲 15 min。9 000 r／min離心10 min。取1 mL左右的上清液經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣測(cè)定。

1.2.2 在線凈化色譜條件

在 線 凈 化 柱 為 Cyclone－P 柱 （50 mm×0.5 mm）；在線凈化流路流動(dòng)相A為10 mmol／L 乙酸銨－0.01%（v／v）乙酸溶液，B 為乙腈，C 為丙酮－乙腈－異丙醇（1∶1∶1，v／v／v）；其在線凈化程序見(jiàn)表1，其中在線凈化程序中每步的變化采用瞬變模式；進(jìn)樣量為50μL。HPLC分析柱為Thermo Phenyl－Hexyl柱（100 mm×2.1 mm，3μm）；流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為0.5%（v／v）的甲酸溶液；HPLC的洗脫梯度見(jiàn)表1，每步的變化除最后一步采用瞬變模式外其他步驟間改變采用漸變模式。整個(gè)運(yùn)行時(shí)間為10 min。方法的流路模式見(jiàn)參考文獻(xiàn)［14］。

表1 在線凈化及色譜分離的梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedures of on－line cleanup and chromatographic separation

1.2.3 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI）；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）正離子掃描模式；電噴霧電壓（IS）4 000 V；毛細(xì)管溫度350℃；輔助氣壓力45 unit；鞘氣壓力30 unit；源內(nèi)誘導(dǎo)解離電壓10 V；碰撞氣壓力200 Pa（1.5 mTorr）；定性離子對(duì)、定量離子對(duì)，碰撞能量見(jiàn)表2。

表2 6種孕激素測(cè)定的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 MS parameters for the determination of the six progesterones

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的選擇

用蠕動(dòng)泵以10μL／min 向質(zhì)譜系統(tǒng)注入1 mg／L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液來(lái)確定分析物的最佳質(zhì)譜條件。在ESI＋掃描方式下分別對(duì)分析物進(jìn)行一級(jí)全掃描（Q1），得到各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的母離子，分析物的分子離子峰［M＋H］＋響應(yīng)值最高，無(wú)［M＋Na］＋和［M＋NH4］＋。分別選擇各母離子進(jìn)行子離子掃描（Q3）得到特征碎片離子并優(yōu)化碰撞能量。選擇響應(yīng)值高、穩(wěn)定且無(wú)干擾的Q1／Q3離子對(duì)為定量和定性離子對(duì)，其優(yōu)化的參數(shù)見(jiàn)表2。

2.2 提取溶液的選擇

一般以乙腈、甲醇、乙酸乙酯及其他不同比例的混合提取液提取孕激素，提取液用固相萃取柱凈化。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)牛奶樣品的特點(diǎn)及孕激素的化學(xué)性質(zhì)，考察了甲醇、乙腈、乙酸乙酯、1%三氯乙酸－乙腈（7∶3，v／v）4種提取液的提取效果，其回收率結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明乙酸乙酯作提取劑時(shí)回收率最低；1%三氯乙酸－乙腈（7∶3，v／v）其次；甲醇和乙腈的回收率相當(dāng)；但甲醇提取后溶液放置一段時(shí)間后會(huì)有白色絮狀物析出，說(shuō)明甲醇沉淀蛋白效果較差，乙腈作提取劑時(shí)回收率穩(wěn)定，且蛋白沉淀效果最好。所以，選擇乙腈作為提取溶劑。

表3 不同提取溶劑的回收率結(jié)果（n＝5）Table 3 Recoveries with different extraction solvents（n＝5） %

2.3 在線凈化條件的選擇

在線固相萃取是用液相泵驅(qū)動(dòng)不同的溶液使分析物在不同階段實(shí)現(xiàn)在在線凈化柱上的保留、洗脫并盡可能地淋洗掉干擾組分。選擇恰當(dāng)?shù)脑诰€凈化柱和每步的流動(dòng)相組成是在線凈化條件優(yōu)化的關(guān)鍵。孕激素極性較弱，反相硅膠型的C18柱和極性修飾的C18－P柱以及聚合物型的Cyclone和極性修飾的Cyclone－P柱均可有效保留孕激素；但Cyclone－P柱更易洗脫，流動(dòng)相中有機(jī)相比例在60%時(shí)就可將分析物完全洗脫；使用較低比例的有機(jī)相會(huì)減小進(jìn)入分析柱后產(chǎn)生的溶劑化效應(yīng)，改善峰形。故選擇Cyclone－P柱為在線凈化柱。

在線凈化過(guò)程主要包括上樣、洗脫轉(zhuǎn)移和淋洗。選擇Cyclone－P柱為在線凈化柱，實(shí)驗(yàn)采用不接分析柱分流進(jìn)質(zhì)譜的方式，優(yōu)化每一步的分析條件。上樣溶液比較了10 mmol／L 乙酸銨－0.02%乙酸水溶液和0.5%甲酸水溶液，結(jié)果顯示用10 mmol／L乙酸銨－0.02%乙酸水溶液作流動(dòng)相時(shí)得到的色譜峰形較好。在洗脫轉(zhuǎn)移這一步驟，對(duì)10 mmol／L乙酸銨－0.02%乙酸水溶液和乙腈的使用比例進(jìn)行了考察，如圖1所示，當(dāng)乙腈的使用比例小于50%時(shí)，洗脫效果明顯變差，因此選定乙腈比例為60%。淋洗這一步驟是分析物在分析柱分離和質(zhì)譜檢測(cè)過(guò)程中，由凈化泵帶著洗脫能力較強(qiáng)的溶劑對(duì)凈化柱進(jìn)行淋洗，并用洗脫溶劑充滿洗脫環(huán)以備下一個(gè)樣品的分析。方法選擇丙酮－乙腈－異丙醇（1∶1∶1，v／v／v）作為強(qiáng)洗脫溶劑，充分淋洗凈化柱，絕大部分雜質(zhì)可淋洗掉，進(jìn)樣500余次后在線凈化柱仍能有效凈化分析物。

2.4 分離條件的優(yōu)化

在流動(dòng)相的選擇上，實(shí)驗(yàn)比較了甲醇和乙腈，結(jié)果表明，甲醇做流動(dòng)相時(shí)分析物的信號(hào)明顯增加。在梯度的優(yōu)化上，因在洗脫轉(zhuǎn)移時(shí)在線凈化流路與HPLC流路合并，兩路混合后在線凈化流路中的有機(jī)相對(duì)分析物的保留行為包括色譜峰形、保留時(shí)間均有明顯影響，故在此步驟應(yīng)設(shè)置高的HPLC流速且高水相比例。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)HPLC流動(dòng)相起始水相比例高于80%時(shí)可有效稀釋合并流路的有機(jī)相，但水相過(guò)高會(huì)延長(zhǎng)分析時(shí)間。綜上考慮，方法選擇了表1的梯度洗脫條件。在優(yōu)化的凈化分析條件下，其MRM色譜圖如圖2所示。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)、線性范圍和測(cè)定低限

實(shí)驗(yàn)采用 Matuszewski等［18］建立的基質(zhì)效應(yīng)確認(rèn)方法，即對(duì)比樣品提取凈化后的基質(zhì)加標(biāo)溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液的響應(yīng)值來(lái)考察方法的基質(zhì)效應(yīng)。當(dāng)比值等于或接近1時(shí)，表明不存在基質(zhì)效應(yīng)的影響；大于1，表明存在離子增強(qiáng)作用；小于1，表明存在離子抑制作用。實(shí)驗(yàn)在5μg／L 水平用牛奶提取液配制的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液與用乙腈配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)值進(jìn)行了對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)比值均在0.9左右（見(jiàn)表4：Ratio－1），說(shuō)明存在一定的基質(zhì)效應(yīng)影響。但經(jīng)同位素校正后，標(biāo)準(zhǔn)溶液中分析物與內(nèi)標(biāo)物的比值和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的分析物與內(nèi)標(biāo)物的比值基本一致（見(jiàn)表4：Ratio－2），表明用同位素內(nèi)標(biāo)稀釋法可有效消除基質(zhì)效應(yīng)的影響。所以，采用溶劑配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，內(nèi)標(biāo)法校正分析結(jié)果。

圖1 洗脫劑中乙腈體積比不同時(shí)的MRM圖Fig.1 MRM chromatograms under different volume ratios of acetonitrile in elution solventNot connected to the analytical column.A：10 mmol／L ammonium acetate－0.01%acetic acid aqueous solution；B：acetonitrile.

圖2 孕激素及內(nèi)標(biāo)物的多反應(yīng)檢測(cè)（MRM）色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of analytes and internal standards

用乙腈配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在選定的色譜和質(zhì)譜條件下進(jìn)樣分析。以分析物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值對(duì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中被測(cè)組分的質(zhì)量濃度作線性回歸，其線性范圍、線性方程和線性相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表5。由結(jié)果可知方法在0.1～50μg／L 范圍內(nèi)呈良好線性，線性相關(guān)系數(shù)在0.999 2～0.999 9 之間。

根據(jù)最終樣液所代表的試樣量、定容體積以及測(cè)定時(shí)所受的干擾情況，確定牛奶中6種分析物的測(cè)定低限（LOQ）為0.5μg／kg。

表4 基質(zhì)效應(yīng)考察結(jié)果Table 4 Results of matrix effect test

表5 線性范圍、線性方程和相關(guān)系數(shù)（R）Table 5 Linear ranges，linear equations and correlation coefficients（R）

2.6 方法的回收率和精密度

用牛奶樣品做添加回收和精密度試驗(yàn)，樣品添加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液后，按1.2節(jié)方法進(jìn)行提取、凈化和測(cè)定，分析結(jié)果見(jiàn)表6。3個(gè)添加水平的回收率在90.8%～107.5%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在6.3%～11.8%之間，方法回收率高，穩(wěn)定性好。

表6 方法的添加回收率和精密度（n＝6）Table 6 Recoveries and precisions of the method（n＝6）

2.7 實(shí)際樣品的測(cè)定

對(duì)市售的10種牛奶及進(jìn)口的乳清粉進(jìn)行抽樣分析，發(fā)現(xiàn)樣品均含有孕酮，含量在1.7～2.6 μg／kg之間，其他5種孕激素均未檢出。

3 結(jié)論

本文建立了在線凈化液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定牛奶中6種常見(jiàn)孕激素類物質(zhì)含量的方法。方法采用乙腈提取，提取液直接進(jìn)樣，在線凈化液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定，同位素內(nèi)標(biāo)法定量。方法的LOQ為0.5μg／kg，滿足國(guó)內(nèi)外的限量要求，方法簡(jiǎn)單快速，回收率高，重現(xiàn)性好，已應(yīng)用在本實(shí)驗(yàn)室的日常檢驗(yàn)中。

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