Turbo flow在線凈化－超高效液相色譜－串聯(lián)質譜法檢測水果中5種咪唑類農藥殘留

張 璐， 孔祥虹， 何 強， 張龍莊， 李建華

（1.陜西出入境檢驗檢疫局，陜西 西安710068；2.西安市產品質量監(jiān)督檢驗院，陜西 西安710068）

咪唑類農藥（吡咪唑、咪唑煙酸、咪鮮胺、咪唑嗪和咪唑菌酮）是目前常用的廣譜高效農藥。農藥的種類增多以及高效、高活性農藥的廣泛應用帶來了相應的環(huán)保問題，主要表現(xiàn)為毒性問題、殘留問題、生態(tài)問題和環(huán)境污染等。這些殘留農藥通過食物鏈的富集作用，可以在動物和人類機體內累積并導致急性或慢性中毒，嚴重威脅著人類的健康生存［1，2］。

傳統(tǒng)的LC－MS／MS在進行化學物質的殘留分析之前，需要對樣品進行大量前處理。目前國內外對水果中農藥殘留的前處理方法主要為固相萃取法［3－9］、基 質分散法［10，11］、QuEChERS［12－14］等。上述方法對農藥殘留均可起到凈化作用但費時費力。相比上述前處理方法，帶有Turbo flow技術（Aria TLX系統(tǒng)）的在線樣品前處理－超高效液相色譜－串聯(lián)質譜系統(tǒng)（TF－UPLC－MS／MS）簡化了樣品制備過程。該技術將前處理系統(tǒng)與色譜分離檢測系統(tǒng)串聯(lián)，實現(xiàn)在線檢測目標。該技術通過擴散溶解、尺寸排阻、柱層析技術將蛋白等一些大分子物質濾掉，保留小分子。每個樣品只需要進行離心去除顆粒狀雜質即可直接進行TF－UPLC－MS／MS分析，省去了樣品預處理中大多數(shù)費時的步驟，不僅提高了樣品處理的通量，還減小了由于操作過程中的錯誤和可變因素而帶來的誤差。與傳統(tǒng)的提取方法相比，該方法進行食品中化學物質殘留分析更快捷，更可靠。目前已采用該系統(tǒng)建立了牛奶中維生素D的檢測方法［15］以及環(huán)境水中磺胺類［16］、皮質類固醇［17］、苯丙三唑類化合物［18］的檢測方法。但目前還未見利用該系統(tǒng)建立水果等復雜樣品中農藥殘留的檢測方法。本文利用TF－UPLC－MS／MS系統(tǒng)建立了水果中5種咪唑類農藥殘留量的檢測方法，并對酥梨、柑橘、蘋果、獼猴桃、葡萄等水果中5種咪唑類農藥的含量進行了測定。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Thermo Science Arial TLX－高效液相色譜－串聯(lián)質譜儀，配TSQ Vantage質譜檢測器（Thermo Science公司）；冷凍離心機（Sigma公司）；多功能振蕩器（IKEA公司）；超純水凈化系統(tǒng)（Millipore公司）。

咪唑煙酸（imazapyr）、咪唑嗪（triazoxide）、吡咪唑（rabenzazole）、咪鮮胺（prochloraz）和咪唑菌酮（fenamidone）標準品均購自德國Dr.Ehrenstorfer GmbH，純度均大于99.0%；色譜純乙腈、甲酸均購自Merck公司；甲酸銨、磷酸二氫鈉、氯化鈉、無水硫酸鈉為分析純。無水硫酸鈉使用前經600℃烘烤。實驗室用水為超純水（18.2 MΩ·cm）。

酥梨、柑橘、蘋果、獼猴桃、葡萄等水果樣品均為市售。

1.2 標準溶液的配制

標準溶液的配制：分別準確稱取咪唑煙酸、咪唑嗪、吡咪唑、咪鮮胺和咪唑菌酮各10.0 mg于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至10 mL，配成1.0 g／L 的標準儲備液，于－20℃下保存。

標準工作溶液的配制：分別取上述儲備液0.025 mL于棕色容量瓶中，用甲醇定容至25 mL，配制成1.0 mg／L 的混合中間標準工作溶液。使用前用乙腈－水（1∶1，v／v）溶液稀釋成系列濃度的混合標準溶液，待用。

1.3 樣品處理

準確稱取3.0 g已打成漿的水果樣品于50 mL具塞離心管中，加入10 mL飽和氯化鈉（pH＝7.0）溶液，再加入5.0 g無水硫酸鈉后，加入10 mL乙腈振蕩提取20 min，于 4 500 r／min 下離心5 min，收集乙腈層于心形瓶中。再加入10 mL乙腈重復上述提取過程一次，于4 500 r／min下離心5 min，合并乙腈層。40℃旋蒸至近干，加入2 mL乙腈－水（1∶1，v／v）溶液定容。過0.22μm有機濾膜后進行TF－UPLC－MS／MS檢測。在樣品中待測物的含量超出線性范圍時，用乙腈－水（1∶1，v／v）溶液稀釋至線性范圍內再檢測。

1.4 TF－UPLC－MS／MS條件

1.4.1 TF條件

TF色譜柱為TF C18（50 mm×1.0 mm），流動相A為乙腈，流動相B為5 mmol／L 甲酸銨溶液（含0.1%（v／v，下同）甲酸），洗脫梯度見表1（left pump），TF連接圖如圖1所示。

表1 Aria TLX Turbo flow的洗脫梯度Table 1 Elution gradient of Aria TLX Turbo flow

圖1 Turbo flow泵連接圖Fig.1 Valve position and instrument configuration of Turbo flowa.extraction of the analytes；b.elution.

1.4.2 液相色譜條件

色譜柱為 Hypersil GOLD aQ （100 mm×2.1 mm）。流動相A為乙腈，流動相B為5 mmol／L甲酸銨溶液（含0.1%甲酸），洗脫梯度見表1（right pump）。進樣量為100μL。

1.4.3 質譜條件

掃描方式：電噴霧正離子模式（ESI＋）；檢測方式：選擇反應監(jiān)測（SRM）；噴霧電壓：3 500 V；氣化溫度：330℃；鞘氣壓（N2）：0.525 L／min（35 arb）；輔助氣壓（N2）：4.5 L／min（15 arb）；離子傳輸管溫度：300 ℃；去簇電壓：2.0 V；碰撞氣體 （Ar）：199.9 MPa（1.5 mTorr），其他參數(shù)見表2。

表2 5種咪唑類農藥的質譜分析參數(shù)Table 2 MS parameters for the five imidazole pesticides

2 結果與討論

2.1 TF條件優(yōu)化

TF條件優(yōu)化分為3個部分：選擇合適的TF柱；選擇合適的上樣條件，包括流速、流動相等；選擇合適的洗脫溶液將保留在TF柱上的目標化合物洗脫下來。

2.1.1 TF凈化柱及流動相溶液的選擇

實驗中分析了目標化合物在TF cyclone－p柱和TF C18柱上的保留情況。結果表明，目標化合物在TF cyclone－p柱上基本無保留，而TF C18柱能達到完全保留。如圖2所示，比較了5 mmol／L甲酸銨溶液、5 mmol／L 甲酸銨溶液（含有0.1%甲酸）和0.1%甲酸水溶液分別作為流動相時目標化合物在TF C18柱上的保留情況。結果表明，0.1%甲酸水溶液和5 mmol／L甲酸銨溶液作為流動相時，目標化合物在TF C18上有保留，但有50%左右的目標化合物流失。以5 mmol／L 甲酸銨溶液（含有0.1%甲酸）為流動相時，5種咪唑類農藥被大部分被保留在TF柱上。當增大溶液中甲酸銨或甲酸含量時目標化合物響應下降且出現(xiàn)流失。因此選擇TF C18柱作為凈化柱，5 mmol／L 甲酸銨溶液（含有0.1%甲酸）作為流動相B。

圖2 不同流動相對5種咪唑類農藥在TF C18柱上保留的影響Fig.2 Effect of different mobile phases on the retentions of the five imidazole pesticides on TF C18 columna.5 mmol／L ammonium format solution（containing 0.1% （v／v）formic acid）as mobile phase；b.5 mmol／L ammonium formate solution as mobile phase；c.0.1% （v／v）formic acid as mobile phase.1.not to be retained part；2.retained part.

2.1.2 TF柱洗脫條件的優(yōu)化

由于吸附在TF柱上的目標化合物需要合適的溶液洗脫進入液相色譜體系分離。因此實驗中對洗脫溶液進行了相應的考察。當洗脫溶液中有機相比例高時能更有效地將5種咪唑類農藥從TF柱上洗脫進入液相色譜體系，但高比例有機相在液相色譜分離時易造成嚴重的溶劑效應。因此盡量選擇較低比例有機相的溶液作為洗脫溶液。實驗中考察了不同比例有機相條件下目標化合物從TF柱上洗脫下來的情況。結果如圖3所示，100%的乙腈可將95%的目標化合物洗脫下來，但是在液相色譜中會出現(xiàn)溶劑峰；當洗脫溶液中含有50%或60%的乙腈時有一部分目標化合物未被洗脫下來。當有機相比例為80%時既能將90%的目標化合物有效地洗脫下來，同時在液相色譜分離時不出現(xiàn)溶劑峰，各化合物得到良好分離。因此實驗中選擇乙腈－5 mmol／L甲酸銨溶液（含0.1%甲酸）（80／20，v／v）作為洗脫溶液。

圖3 乙腈－5 mmol／L 甲酸銨（含0.1%甲酸）溶液中乙腈的體積分數(shù)對5種咪唑類農藥洗脫效果的影響Fig.3 Elution effect of different volume percentages of acetonitrile in acetonitrile－5 mmol／L ammonium formate（containing0.1%formic acid）solution for the five imidazole pesticidesa.100%acetonitrile；b.50%acetonitrile；c.80%acetonitrile.1.not to be retained part；2.eluted part.

洗脫速率對5種咪唑類化合物在液相色譜上的分離有顯著的影響。如圖4所示，當洗脫速率為0.1 mL／min 時，咪唑煙酸峰有嚴重拖尾；改變流速為0.05 mL／min時，咪唑菌酮峰有拖尾；改變流速為0.07 mL／min 時，目標化合物完全洗脫且在液相色譜中達到良好分離，因此實驗中選擇0.07 mL／min為TF柱的洗脫速率。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 流動相的選擇

分析比較了乙腈－水、乙腈－0.1%甲酸水溶液、乙腈－5 mmol／L 甲酸銨溶液、乙腈－5 mmol／L 甲酸銨溶液（含0.1%的甲酸）作為流動相時目標化合物的保留和峰形。結果表明，流動相中加入適量的甲酸銨有助于目標化合物的保留，但峰形會有拖尾；加入甲酸后，出峰時間提前且峰形更加對稱；同時在正離子模式下，加入甲酸有利于目標化合物的離子化。因此實驗中選擇乙腈－5 mmol／L 甲酸銨溶液（含0.1%的甲酸）作為流動相。

2.2.2 色譜柱的選擇

圖4 不同洗脫速率下混合標準溶液的TF－UPLC－MS／MS總離子流圖Fig.4 TF－UPLC－MS／MS TIC chromatograms of standard solution at different elution ratesElution rates：a.0.07 mL／min；b.0.1 mL／min；c.0.05 mL／min.Peaks：1.imazapyr；2.triazoxide；3.rabenzazole；4.fenamidone；5.prochloraz.

實驗中比較了Hypersil GOLD色譜柱和Hypersil GOLD aQ色譜柱的分離效果。發(fā)現(xiàn)5種咪唑類農藥在Hypersil GOLD aQ柱上的分離效果明顯優(yōu)于在Hypersil GOLD柱上的分離效果。這是因為Hypersil GOLD aQ柱擁有極性封端的C18固定相，同時該柱能耐受100%的水相且保持其性能穩(wěn)定，因此該柱對中等極性化合物具有良好的保留能力和分離度。故選擇Hypersil GOLD aQ色譜柱作為分析柱，典型的蘋果基質加標色譜圖見圖5。

2.3 提取條件的選擇

考察了分別采用10%（質量分數(shù)）Na2HPO4－飽和氯 化 鈉 溶 液 （pH＝2.0、4.0、6.0、7.8、8.5 和9.0）、飽和氯化鈉溶液（pH＝7.0）溶解樣品，乙腈提取時，對目標化合物提取效果的影響。實驗結果發(fā)現(xiàn)，當溶解溶液為10%Na2HPO4－飽和氯化鈉溶液（且pH＞7.0）時，咪唑煙酸、咪鮮胺的回收率均偏低。當10%Na2HPO4－飽和氯化鈉溶液的pH＝9.0時，5種咪唑農藥的回收率均低于65%。說明在堿性條件下目標化合物不能被完全提取。當10%Na2HPO4－飽和氯化鈉溶液的pH＝4.0時，咪唑煙酸、咪唑嗪、吡咪唑、咪鮮胺的回收率偏高，尤其對咪唑煙酸影響較大。當加標水平為0.005 mg／kg時，咪唑煙酸的回收率達到145.1%，說明在弱酸性條件下，基質增強效應較強。當采用飽和氯化鈉溶液（pH＝7.0）為溶解溶液、乙腈提取時，有機相與水相分層明顯，5種咪唑類農藥的回收率均在80%～110%之間（見圖6）。說明在該條件下，基質效應得到抑制，目標化合物基本上被完全提取。因此選擇飽和氯化鈉溶液（pH＝7.0）溶解樣品，乙腈提取樣品。

2.4 方法的線性范圍、回收率和精密度

圖5 蘋果基質加標樣品（0.01 mg／L）的選擇反應監(jiān)測（SRM）色譜圖Fig.5 Selected reaction monitoring（SRM）chromatograms of standards （0.01 mg／L）spiked in apple matrix

圖6 不同溶解溶液下乙腈對5種咪唑類農藥提取效果的比較Fig.6 Comparison of extraction efficiencies of the five imidazole pesticides by acetonitrile under different dissolved solutions

按1.2節(jié)方法制備1.0 mg／L 的5種咪唑類農藥標準溶液，用乙腈－水（1∶1，v／v）溶液稀釋，依次得到質量濃度為 0.007 5、0.01、0.03、0.05、0.75 mg／L的標準溶液。按優(yōu)化條件進行測定，外標法定量。5種咪唑類農藥的相關系數(shù)（r2）均大于0.99。在樣品中加入低濃度的5種咪唑類農藥混合標準溶液（加入量15 ng），重復測定6份樣品，以信噪比（S／N）大于10確定定量限（LOQ）為0.005 mg／kg，低 于 日 本 肯 定 列 表 的 一 律 標 準 （0.01 mg／kg）。分別對酥梨、柑橘、蘋果、獼猴桃、葡萄等5種水果樣品進行4個水平的加標回收率測定，回收率為71.2%～122.4%，RSD 為0.5%～8.9%（見表3）。

2.5 實際樣品分析

按本文建立的方法對市售的20批酥梨、14批柑橘、29批獼猴桃、15批蘋果、10批葡萄樣品中的5種咪唑類農藥進行測定。每批樣品從稱樣到檢測完畢只需40 min，與傳統(tǒng)固相萃?。璍C－MS／MS檢測相比樣品分析時間縮短約3 h。

實際檢測結果顯示，在大部分獼猴桃、蘋果、酥梨、葡萄樣品中沒有檢出這5種咪唑類農藥，在10批柑橘樣品中檢出咪鮮胺，含量為0.096～0.5 mg／kg，推測在柑橘生長過程中使用了咪鮮胺進行炭疽病的防治。

表3 5種水果中5種咪唑類農藥的回收率及相對標準偏差（n＝5）Table 3 Recoveries and relative standard deviations（RSDs）of the five imidazole pesticidesspiked in five kinds of fruit samples（n＝5）

3 結論

建立了Turbo flow－超高效液相色譜－串聯(lián)質譜同時測定水果中吡咪唑、咪唑煙酸、咪鮮胺、咪唑嗪和咪唑菌酮等5種咪唑類農藥的檢測方法。在優(yōu)化條件下，5種咪唑類農藥在40 min內完成樣品前處理和樣品測定，且在色譜分離中達到良好分離，其定量限均可達到0.005 mg／kg。該方法快速、簡單，靈敏度高，穩(wěn)定性好，能很好的應用于實際水果樣品中咪唑類農藥的日常檢測。

［1］ Li F，Hu J M，Li F G，et al.Chinese Journal of Health Laboratory Technology（李芳，胡建民，李鋒格，等.中國衛(wèi)生檢驗雜志），2011，2（10）：2416

［2］ Liu X C，Chen P，Shen J，et al.Journal of Analytical Science（柳訓才，陳平，沈菁，等.分析科學學報），2007，23（5）：523

［3］ Li C，Suo R，Wang F C，et al.Chinese Journal of Chromatography（李成，鎖然，王鳳池，等.色譜），2008，26（6）：726

［4］ Zhao Z Y，Shi Z H，Kang J，et al.Chinese Journal of Chromatography（趙志遠，石志紅，康健，等.色譜），2013，31（4）：372

［5］ Chen X L，Li Z X，Cao Z Y，et al.Chinese Journal of Chromatography（陳小龍，李正翔，曹趙云，等.色譜），2013，31（10）：945

［6］ Huang J R，Kong X H，Yao B H，et al.Chinese Journal of Chromatography（黃江銳，孔祥虹，姚秉華，等.色譜），2011，29（10）：974

［7］ Mou Y L，Guo D H，Ding Z P.Chinese Journal of Chromatography（牟艷莉，郭德華，丁卓平.色譜），2013，31（10）：1016

［8］ Xu X L，Zhao H X，Li L，et al.Chinese Journal of Chromatography（許秀麗，趙海香，李禮，等.色譜），2012，30（3）：267

［9］ Ouyang Y F，Tang H B，Wu Y，et al.Chinese Journal of Chromatography（歐陽運富，唐宏兵，吳英，等.色譜），2012，30（7）：654

［10］ Ma Z L，Zhao W，Li L Y，et al.Chinese Journal of Chromatography（馬智玲，趙文，李凌云，等.色譜），2013，31（3）：228

［11］ Lin H D，Zou Z F，Qin Y，et al.Chinese Journal of Chromatography（林海丹，鄒志飛，秦燕，等.色譜），2013，31（2）：170

［12］ Song Y.［MS Dissertation］.Beijing：Chinese Academy of Agriculture Sciences（宋瑩.［碩士學位論文］.北京：中國農業(yè)科學院），2011

［13］ Lehotay S J，de Kok A，Hiemstra M，et al.J AOAC Int，2005，88（2）：595

［14］ Paya P，Anastassiades M，Mack D，et al.Anal Bioanal Chem，2007，389（6）：1697

［15］ Shi Y，Lafontaine C，Berube M，et al.Thermo Scientific Application Note 568.［2014－02－17］.http：／www.cohesivetech.Com／publications／search－publications／articles＿detail.cfm？file＿id＝239＆mode＝list＆author＝＆keywords＝

［16］ Garcia－Galan M J，Diaz－Cruz M S ，Barcelo D. Talanta，2010，81：355

［17］ Fayad P B，Prévost M，SauvéS.Talanta，2013，115：349

［18］ Liu R Z，Ruan T，Wang T，et al.Talanta，2014，120：158