復(fù)合免疫親和柱凈化－液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定動(dòng)物源性食品中6種玉米赤霉醇類化合物和氯霉素殘留量

王 清， 王國民， 郗存顯， 李賢良， 陳冬東，唐柏彬， 張 雷， 趙 華＊

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，重慶400016；2.重慶出入境檢驗(yàn)檢疫局，重慶市進(jìn)出口食品安全工程技術(shù)研究中心，重慶400020；3.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京100123）

玉米赤霉醇類化合物（zeranols，ZER）是由多種鐮刀霉菌產(chǎn)生的非甾體同化激素，包括玉米赤霉烯酮（ZON）、α－玉米赤霉醇（α－ZAL）、β－玉米赤霉醇（β－ZAL）、α－玉米赤霉烯醇（α－ZOL）、β－玉米赤霉烯醇（β－ZOL）和玉米赤霉酮（ZAN）等，具有促進(jìn)蛋白質(zhì)合成的作用，曾被用作家畜促增長劑［1］。氯霉素（CAP）是一種廣譜抗生素，對(duì)革蘭氏陰性菌和陽性菌均有良好的抑制作用，曾廣泛應(yīng)用于動(dòng)物細(xì)菌感染的臨床治療。研究表明，ZER具有生殖毒性、免疫毒性和基因毒性等毒副作用［2］，CAP具有抑制骨髓造血、灰嬰綜合征、神經(jīng)毒性等毒副作用［3，4］。在動(dòng)物源性食品中殘留的ZER和CAP可通過食物鏈對(duì)人類的健康構(gòu)成潛在危害。我國農(nóng)業(yè)部第235號(hào)公告《動(dòng)物源性食品中獸藥最高殘留限量》中明確規(guī)定，在動(dòng)物源性食品中不得檢出CAP和ZER［5］。

液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法（LC－MS／MS）具有高的選擇性和靈敏度，被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物源性食品中真菌毒素和獸藥的殘留檢測［6，7］。但動(dòng)物源性食品的基質(zhì)非常復(fù)雜，如果不經(jīng)過凈化去除基質(zhì)影響，會(huì)影響LC－MS／MS的準(zhǔn)確性和靈敏度。樣品前處理凈化技術(shù)主要有液－液萃取和固相萃取，但兩者均耗費(fèi)試劑，操作步驟繁瑣且專屬性差。免疫親和柱（IAC）作為一種優(yōu)良的前處理技術(shù)，具有良好的專屬性和高富集性，被廣泛應(yīng)用于真菌毒素和獸藥的殘留分析［8，9］。針對(duì)ZER或者CAP凈化的免疫親和柱，只單一的包含了ZER或者CAP的抗體，不能同時(shí)凈化富集同一樣品中的ZER和CAP；而復(fù)合免疫親和柱（IAC－CZ柱）同時(shí)包含了ZER和CAP抗體，能同時(shí)對(duì)ZER和CAP進(jìn)行富集凈化，從而提高了樣品中ZER和CAP的檢測效率。本文建立了采用IAC－CZ柱凈化、LC－MS／MS同時(shí)檢測魚肉、豬肝、牛奶、蜂蜜中ZER和CAP殘留的方法，對(duì)同時(shí)檢測動(dòng)物源性食品中的ZER和CAP具有重要意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LC－20A液相色譜儀（日本Shimadzu公司）和API4000串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國AB公司）；XH－B型振蕩器（江蘇康健醫(yī)療用品有限公司）；3－30K臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國Sigma公司）；ZHWY－2112B恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智誠分析儀器制造有限公司）；N－EVAP 116氮?dú)獯蹈蓛x（美國Organomation Associates公司）；Milli－Q超純水系統(tǒng)（美國 Millipore公司）。

IAC－CZ柱（柱容量100 ng，3 mL，北京中檢維康技術(shù)有限公司；4℃冰箱中保存）；HLB固相萃取柱（60 mg，3 mL，美國Supelco公司）；C18固相萃取柱（1.0 g，6 mL，美國Supelco公司）；NH2固相萃取柱（500 mg，3 mL，美國Supelco公司）；MCX固相萃取柱（60 mg，3 mL，美國 Waters公司）；β－葡萄糖苷酸／硫酯酸復(fù)合酶（美國Sigma公司）；乙腈、甲醇、叔丁基甲醚、乙醚、乙酸乙酯等試劑為色譜純，氫氧化鈉、乙酸鈉、氯化鉀等試劑為分析純；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

α－玉米赤霉醇、β－玉米赤霉醇、α－玉米赤霉烯醇、β－玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮和玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥98.0%，購自美國Sigma公司。氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥98.5%，購自德國Dr.Ehrenstorfer公司。

魚肉、豬肝、牛奶、蜂蜜等樣品購自當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2 溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液和基質(zhì)曲線溶液：用甲醇配制ZER和CAP的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，質(zhì)量濃度均為100 mg／L，于－18℃下保存。用25%乙腈水溶液將ZER和CAP標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.2、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0μg／L（ZER）和 CAP為0.1、0.25、0.5、2.5、5.0、25.0μg／L（CAP）的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。用空白魚肉（或蜂蜜、牛奶、豬肝）基質(zhì)溶液稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制成與標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液相同濃度的系列基質(zhì)曲線溶液。

乙酸鈉緩沖液：稱取6.80 g乙酸鈉，用900 mL超純水溶解，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH為4.80，定容至1 L。

PBS 溶 液：分 別 稱 取 8.00 g NaCl、2.90 g Na2HPO4·12H2O、0.24 g KH2PO4和 0.20 g KCl，用 900 mL 超 純 水 溶 解，再 用 1.0 mol／L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為7.40，用水定容至1 L。

1.3 LC－MS／MS條件

色 譜 柱：Shimadzu Shim－pack VP－ODS（150 mm×2.0 mm，5μm）。流動(dòng)相：A相為乙腈，B相為2 mmol／L 乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）。梯度洗脫程序：0～4.0 min，25%A～75%A；4.0～7.0 min，75%A；7.0～7.5 min，75%A～25%A；7.5～8.0 min，25%A。流速：0.30 mL／min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：10μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧負(fù)離子－多反應(yīng)監(jiān)測（ESI－－MRM）模式檢測；電噴霧電壓：－4.5 kV；霧化氣壓力：0.24 MPa；氣簾氣壓力：0.28 MPa；輔助氣壓力：0.41 MPa；離子源溫度：550℃；其他主要質(zhì)譜條件見表1。

表1 ZER和CAP測定的主要質(zhì)譜條件Table 1 Main mass spectrometric conditions for the determination of ZER and CAP

1.4 供試品制備

1.4.1 樣品的提取

魚肉、蜂蜜、豬肝：準(zhǔn)確稱取勻漿后的樣品5.00 g于50 mL具塞離心管中，加入10.0 mL乙酸鈉緩沖液和50μLβ－葡萄糖苷酸／硫酸酯復(fù)合酶，渦旋混勻；置于37℃恒溫振蕩器（轉(zhuǎn)速為100 r／min）中酶解16 h，冷卻至室溫后，用20.0 mL乙醚振蕩提取30 min，于 5 000 r／min下離心5 min，將上層乙醚液轉(zhuǎn)移至另一離心管中。余下水層中加入100μL1 mol／L NaOH溶液，混勻，用20.0 mL乙醚重復(fù)提取1次。合并提取液，于40℃下用氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)?.0 mL 50%乙腈水溶液復(fù)溶，用0.22μm濾膜過濾（若溶液渾濁，可于5 000 r／min下離心3 min后再過濾）。取濾液0.5 mL，用PBS稀釋至5 mL，混勻，待凈化。

牛奶：準(zhǔn)確稱取勻漿后樣品5.00 g于50 mL具塞離心管中，加入10.0 mL乙酸鈉緩沖液和50μL β－葡萄糖苷酸／硫酸酯復(fù)合酶，渦旋混勻；置于37℃恒溫振蕩器（轉(zhuǎn)速為100 r／min）中酶解16 h，冷卻至室溫，加入5.0 g NaCl，渦旋混勻后，用20.0 mL乙醚振蕩提取30 min，于 7 000 r／min 下離心10 min，剩余操作同上。

1.4.2 IAC－CZ柱凈化

將待凈化液通過IAC－CZ柱，用5.0 mL PBS和5.0 mL水淋洗，抽干。用2.0 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，于40℃下氮?dú)鈸]干，用1.0 mL 25%乙腈水溶液溶解并過濾（0.22μm有機(jī)濾膜），濾液供LC－MS／MS分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1 溶液pH對(duì)提取效率的影響

據(jù)報(bào)道，ZER在弱酸性及中性條件下易溶于有機(jī)溶劑［10］，而CAP在弱堿條件下能得到較好的提取效果［11］。在pH4.8時(shí)，ZER的提取效率≥90%，而CAP的提取效率僅為50%～70%。當(dāng)pH為7.5±0.5時(shí)，CAP的回收率≥95%。本實(shí)驗(yàn)采用調(diào)節(jié)下層水溶液pH的方法，經(jīng)兩步提取，可最大限度地提取基質(zhì)中的ZER和CAP。

2.1.2 提取溶劑的選擇

本實(shí)驗(yàn)考察了乙醚、叔丁基甲醚、乙酸乙酯和乙腈對(duì)幾種基質(zhì)中ZER和CAP的同時(shí)提取效率。稱取肝臟、蜂蜜、魚肉等空白基質(zhì)，分別添加10μg／kg的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，再分別以乙醚、叔丁基甲醚、乙酸乙酯和乙腈為提取溶劑，按1.4節(jié)處理，結(jié)果（見表2）表明乙醚的提取效果較好，在不同基質(zhì)中ZER和CAP的回收率均在90%以上。因此實(shí)驗(yàn)選擇乙醚作為提取溶劑。

2.2 IAC－CZ柱凈化條件的優(yōu)化

2.2.1 過濾不溶性雜質(zhì)

以乙醚作為提取溶劑時(shí)會(huì)同時(shí)提取出部分雜質(zhì)。提取液吹干后，用1 mL 50%乙腈溶液溶解殘?jiān)?，乙腈溶液中含有大顆粒的不溶性雜質(zhì)，這些大顆粒雜質(zhì)進(jìn)入色譜柱容易堵塞柱，阻礙分析物與特異性抗體相結(jié)合，影響IAC－CZ柱的凈化效果，對(duì)IAC－CZ柱的壽命也有一定的影響。因此，本實(shí)驗(yàn)采用0.22μm的濾膜過濾乙腈溶液，可有效減少大顆粒雜質(zhì)對(duì)IAC－CZ柱凈化過程的干擾。

表2 不同溶劑對(duì)基質(zhì)中ZER和CAP的提取回收率Table 2 Extraction recoveries of ZER and CAP in matrices with different solvents

2.2.2 上載溶液中乙腈含量的考察

本實(shí)驗(yàn)考察了上載溶液中乙腈含量對(duì)IAC－CZ柱富集效果的影響。當(dāng)乙腈含量≤10%時(shí)，ZER和CAP的回收率無明顯差別（見圖1），免疫親和柱中抗體和分析物的特異性結(jié)合作用不受影響。因此，上載溶液中乙腈的含量控制在5%。

圖1 上載溶液乙腈含量對(duì)IAC－CZ柱富集作用的影響Fig.1 Effect of acetonitrile content in loading solution on the enrichment function of IAC－CZ column

2.2.3 淋洗液和洗脫液的考察

淋洗液選用5 mL PBS溶液和5 mL水，PBS溶液有助于洗脫上載溶液中的非特異性雜質(zhì)，水可以洗脫非特異性雜質(zhì)以及PBS溶液中的鹽。淋洗過程中無目標(biāo)物被洗脫。

為確保目標(biāo)物完全洗脫，本實(shí)驗(yàn)考察了洗脫液甲醇的體積對(duì)洗脫率的影響。結(jié)果見圖2，隨著洗脫液甲醇體積的增加，洗脫率提高，當(dāng)甲醇體積達(dá)到2 mL及以上時(shí)，洗脫率趨于穩(wěn)定。因此本方法采用2 mL甲醇洗脫。

圖2 甲醇體積對(duì)目標(biāo)物洗脫率的影響Fig.2 Effect of methanol volume on the elution rates of the analytes

2.3 IAC－CZ柱與其他凈化柱凈化能力的比較

常用于ZER或CAP凈化的固相萃取柱（SPE）有 HLB 柱［12，13］、NH2柱［14，15］、C18柱［16，17］、MCX柱［18，19］等。本文比較了常用的 SPE 柱與IAC－CZ柱對(duì)ZER和CAP的凈化效果。稱取魚肉基質(zhì)加入5.0μg／kg 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液后，按照1.4.1節(jié)提取，分別在不凈化、固相萃取柱凈化、IAC－CZ凈化處理提取液后，用LC－MS／MS測定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3（以β－ZAL的LC－MS／MS圖為例）?；|(zhì)樣品不經(jīng)過凈化直接過濾后進(jìn)樣分析，基質(zhì)影響明顯，對(duì)主成分的測定干擾很大（圖3a）；HLB柱、NH2柱、C18柱、MCX柱有一定的凈化能力，但基質(zhì)干擾還是非常明顯（圖3b～3e）；IAC－CZ具有良好的凈化效果，能有效減小基質(zhì)影響，LC－MS／MS譜圖中基線穩(wěn)定，主成分峰不受干擾（圖3f）?；谔禺愋陨锓磻?yīng)原理的免疫親和柱凈化方法越來越廣泛地用于ZER或 CAP 的 殘 留 分 析［11，13］，本 文 使 用IAC－CZ柱同時(shí)富集ZER和CAP，凈化效果良好，適合ZER和CAP的殘留分析。

圖3 （a）未經(jīng)凈化和經(jīng)（b）MCX、（c）HLB、（d）C18、（e）NH2 和（f）IAC－CZ柱凈化的魚肉基質(zhì)中β－ZAL的 LC－MS／MS譜圖Fig.3 LC－MS／MS chromatograms ofβ－ZAL in the fish matrix（a）without clean－up and cleaned－up by（b）MCX，（c）HLB，（d）C18，（e）NH2and（f）IAC－CZ cartridges

2.4 線性方程、檢出限、定量限和基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)

取1.2節(jié)中標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液和各基質(zhì)曲線溶液進(jìn)樣分析，以定量離子對(duì)的響應(yīng)值為y，以質(zhì)量濃度為x作線性回歸，考察標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線和各基質(zhì)曲線的線性范圍、相關(guān)系數(shù)及儀器的檢出限和定量限，結(jié)果見表3。可見標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2≥0.999 0，各基質(zhì)曲線的R2≥0.998 0，表明標(biāo)準(zhǔn)曲線與各基質(zhì)曲線的線性范圍良好。信噪比為3或10時(shí)，分別得出儀器檢出限為0.04～0.10μg／kg，定量限為0.10～0.40 μg／kg。

基質(zhì)效應(yīng)用基質(zhì)曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率比值（SSE）來評(píng)價(jià)［20，21］。SSE為90.8%～108.0%，表示基質(zhì)效應(yīng)不明顯，說明經(jīng)過IAC－CZ柱凈化后，基質(zhì)對(duì)目標(biāo)物的測定無明顯干擾，可以用外標(biāo)法定量。

表3 各分析物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限和基質(zhì)效應(yīng)Table 3 Linear equations，correlation coefficients，limits of detection（LODs），limits of quantification（LOQs）and matrix effects（SSEs）of the analytes

表3 （續(xù)）Table 3 （Continued）

2.5 回收率和精密度

稱取空白魚肉（或蜂蜜、牛奶、豬肝）樣品，分別添加低、中、高水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，渦旋混勻后，按照1.4節(jié)處理后測定，每個(gè)添加水平重復(fù)6次，外標(biāo)法定量，計(jì)算平均回收率和精密度。由表4可知，7種分析物的平均回收率在70.9%～95.6%之間，RSD在2.0%～11.8%之間，表明該方法的回收率和精密度均良好。

表4 空白基質(zhì)中各分析物的加標(biāo)回收率和精密度（n＝6）Table 4 Recoveries and RSDs of the analytes spiked in blank samples（n＝6）

3 結(jié)論

本文利用復(fù)合免疫親和柱同時(shí)凈化富集樣品中的ZER和CAP，建立了針對(duì)ZER和CAP殘留的LC－MS／MS定量分析方法。該復(fù)合免疫親和柱具有獨(dú)特的專屬性和良好的凈化效能，可有效地富集不同基質(zhì)中的ZER和CAP，最大程度地消除基質(zhì)對(duì)分析的干擾。LC－MS／MS分析方法靈敏度高，分析結(jié)果可靠，分析時(shí)間短，提高了殘留檢驗(yàn)工作的效率。本方法具有良好的回收率和精密度，分析方法穩(wěn)定。該方法對(duì)不同基質(zhì)均有良好的適用性，具有良好的應(yīng)用前景。

［1］ Thevis M，F(xiàn)ussholler G，Schanzer W.Drug Test Anal，2011，3（11／12）：777

［2］ Zinedine A，Soriano J M，Molto J C，et al.Food Chem Toxicol，2007，45（1）：1

［3］ Wong S，Silva F，Acheson J，et al.J R Soc Med Sh Rep，2013，4（3）：20

［4］ Wang Y S，Chen X H.Chinese Journal of Critical Care Medicine（王育珊，陳星海.中國急救醫(yī)學(xué)），2003，23（7）：497

［5］ Ministry of Agriculture.No.235 Bulletin of the Ministry of Agriculture of the People’s Republic of China.The Maximum Residue Limit of Veterinary Drugs in Animal Derived Foods（農(nóng)業(yè)部.中華人民共和國農(nóng)業(yè)部第235號(hào)公告.動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量）.（2002－12－24）.http：／jckspaqj.aqsiq.gov.cn／dwyxspjyjy／gnxgbz／200610／t20061027－9809.htm

［6］ Taka T，Baras M C，Chaudhry Bet Z F.Food Addit Contam，2012，29（4）：596

［7］ You L N，Li X L，Xi C X，et al.Chinese Journal of Chromatography（游麗娜，李賢良，郗存顯，等.色譜），2012，30（10）：1021

［8］ Senyuva H Z，Gilbert J.J Chromatogr B，2010，878（2）：115

［9］ Tsikas D.J Chromatogr B，2010，878（2）：133

［10］ Li X L，You L N，Xi C X，et al.Chinese Journal of Analytical Chemistry（李賢良，游麗娜，郗存顯，等.分析化學(xué)），2013，41（8）：1147

［11］ Zhang Q J.［MS Dissertation］.Hengyang：Nanhua University（張清杰.［碩士學(xué)位論文］.衡陽：南華大學(xué)），2013

［12］ Lin S S，Yi Q T，Hong J J，et al.Chinese Journal of Chromatography（林姍姍，易啟同，洪家俊，等.色譜），2013，31（10）：980

［13］ Zhu W X，Liu Y F，Yuan P，et al.Chinese Journal of Chromatography（祝偉霞，劉亞風(fēng)，袁萍，等.色譜），2010，23（11）：1031

［14］ Qian Z Z，Liu Z Y，Deng W J，et al.South China Fisheries Science（錢卓真，劉智禹，鄧武劍，等.南方水產(chǎn)科學(xué)），2011，7（1）：62

［15］ Wang S，Zhang J，Shao B.Journal of Instrumental Analysis（王碩，張晶，邵兵.分析測試學(xué)報(bào)），2013，32（2）：179

［16］ Peng T，Li S J，Chu X G，et al.Chinese Journal of Analytical Chemistry（彭濤，李淑娟，儲(chǔ)曉剛，等.分析化學(xué)），2005，33（4）：463

［17］ SN／T1544－2005

［18］ Zhang Y，Li H，Zhang J X，et al.Chinese Journal of Analytical Chemistry（張巖，李揮，張敬軒，等.分析化學(xué)），2009，37（11）：1683

［19］ Qiao J，Yang S Y，Liu M L.Chinese Journal of Forensic Medicine（喬靜，楊士云，劉美麗.中國法醫(yī)學(xué)雜志），2009，24（5）：321

［20］ Taylor P J.Clin Biochem，2005，38（4）：328

［21］ Han Z，Ren Y P，Zhou H L，et al.J Chromatogr B，2011，879（5）：411