植物激素樣品前處理方法的研究進展

吳 倩， 王 璐， 吳大朋， 段春鳳， 關亞風，*

(1.中國科學院大連化學物理研究所，中國科學院分離分析化學重點實驗室，遼寧大連116023;2.中國科學院大學，北京100049;3.中國科學技術大學化學系，安徽合肥230026)

植物激素是一類植物自身合成的痕量化合物。其主要功能是參與調(diào)控植物的整個生長過程，包括種子休眠、萌發(fā)、營養(yǎng)、生長、生殖、成熟到衰老以及一些對外界的應激反應等，對植物的每一個生命過程都起著重要作用［1］。通過調(diào)控植物激素的代謝可顯著改良作物株型，提高作物的產(chǎn)量或品質(zhì)［2］。準確檢測植物激素在植物內(nèi)的濃度變化以及組織特異性分布，是了解其代謝途徑和運輸過程的重要前提，而這就要求發(fā)展準確高效的定性定量分析方法。

植物激素主要包括生長素、赤霉素(gibberellins，GAs)、細胞分裂素、脫落酸、茉莉酸、水楊酸、油菜素甾醇(brassinosteroids，BRs)以及多肽激素［1］。檢測主要有3個難點。一是有些重要激素的含量極低，通常都在ng/g甚至pg/g的數(shù)量級。不同的激素含量分布也比較廣，如生長素、細胞分裂素、脫落酸、茉莉酸和水楊酸一般都在1～100 ng/g鮮重［3］，而赤霉素的含量則較之低一個數(shù)量級［4］。含量最低的油菜素甾醇通常含量在0.01～0.1 ng/g鮮重［5］。如此低的含量要求其檢測方法和儀器對植物激素具有超高的靈敏度。二是植物激素一般不穩(wěn)定、易分解、對溫度和介質(zhì)環(huán)境比較敏感［6］。如赤霉素類激素對環(huán)境pH十分敏感，通常在偏酸性條件下才比較穩(wěn)定［1］;同時赤霉素對于溫度也十分敏感，溫度超過40℃就會發(fā)生快速分解［7］。三是植物樣品基質(zhì)十分復雜，直接檢測會受到大量基質(zhì)干擾物的影響。因此對樣品處理方法的選擇性和除雜能力有很高的要求［8］。

目前植物激素的檢測方法非常多，主要可分為生物鑒定法、免疫分析法和色譜分析法3類［8］。生物鑒定法是一種非常經(jīng)典的植物激素檢測分析法。例如油菜素內(nèi)酯(brassinolide)的水稻葉彎曲測試法(rice-lamina inclination test)可達到0.05 ng/mL的檢測限［5］。但它只是一種半定量方法，而且其耗時長，對檢測條件要求嚴苛。一般的化學分析實驗室難以實現(xiàn)。而免疫分析法近年來顯示出較低檢測限，但是其仍需解決制備的抗體的交叉反應問題［9，10］。目前，色譜法應用最廣［11］，可同時檢測多種植物激素［12］，且定量準確［13］。近年來，色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術快速發(fā)展，對植物激素的選擇性檢測能力有極大提高，能夠?qū)崿F(xiàn)準確定性［14］。

對于色譜法而言，樣品前處理是其最為重要的環(huán)節(jié)之一。前處理決定著分析的準確性和精密度，也是整個分析過程中耗時最長的步驟。而且，植物激素含量低，易分解且基質(zhì)復雜，這對樣品前處理的選擇性富集能力，以及操作條件都提出了更高要求。

植物激素的化學特性是決定其前處理方法的重要因素。按極性差異，植物激素可簡單分為3類。第1類是中極性植物激素，包括生長素、赤霉素、脫落酸、細胞分裂素、茉莉酸和水楊酸等，多是弱酸性。其他為堿性，統(tǒng)稱為酸性或堿性植物激素。第2類是強極性植物激素，主要就是植物多肽類，它們都是由氨基酸組成的肽段，因此為兩性化合物，極性很強。而第3類就是弱極性植物激素，主要為油菜素甾醇類，它們都是中性化合物，沒有電離能力。以下就以此3類來分別介紹植物激素前處理方法的研究進展。

1 酸性或堿性植物激素

圖1 酸性或堿性植物激素的主要結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of acidic and basic phytohormonesAuxins:R=COOH，CH2COOH，CH2CH2CH2COOH，CH2COOCH3.Jasmonates:R=OH，OCH3，NHCH(COOH)CH(CH3)C2H5.Salicylates:R1=COOH，COOCH3，CH=CHCOOH;R2=H or OH.Gibberellins:R=H or OH，positions C1-2，2-3，9-11 are single bond or double bond.Cytokinins:R1=CH2CH=C(CH3)CH2OH，CH2CH2CH(CH3)CH2OH，CH2CH=C(CH3)CH3，CH2-phenyl，CH2-phenyl-OH，CH2-furan;R2=H，β-D-ribofuranosyl，β-D-ribofuranosyl-5'-monophosphate，β-D-glucopyranosyl.

生長素是最先被發(fā)現(xiàn)的一類植物激素，為一系列吲哚衍生物，主要包括吲哚-3-乙酸、吲哚-3-丁酸等，主要功能是調(diào)節(jié)植物生長和細胞分裂等［1］;赤霉素是一類四環(huán)二萜羧酸類化合物，包括已發(fā)現(xiàn)的136種類似物，主要功能是調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育，包括種子萌芽、莖和葉的生長以及開花［1，15］;脫落酸是一種單環(huán)倍半萜類化合物，主要功能是調(diào)節(jié)植物種子萌芽和氣孔閉合［16］;茉莉酸是十二碳的環(huán)戊烷酮酸，主要作為植物受到外界傷害時產(chǎn)生的抵御信號［1，17］。它們的基本結(jié)構(gòu)如圖1所示。其物理化學性質(zhì)如表1所示。由此可見，雖然這些激素的功能各不相同，但其化學性質(zhì)很類似，都為相對分子質(zhì)量100～400之間的小分子弱酸。因此大部分色譜分析法可以對其做到同時檢測。前處理通常會利用它們的弱酸性和極性進行分離。而細胞分裂素則是一類氮雜環(huán)的堿性小分子，主要功能是推動細胞分裂、種子發(fā)芽以及芽的形成等過程，其極性與前面的弱酸性植物激素類似［1，18］。

表1 主要植物激素的物理化學性質(zhì)Table 1 Physical and chemical properties of major phytohormones

1.1 樣品提取

植物樣品大多為固態(tài)，需要通過浸提將分析物轉(zhuǎn)移到液態(tài)溶液中，方便后續(xù)分析操作。浸提的過程比較單一，對于弱酸弱堿類植物激素，通常采用甲醇、異丙醇或乙腈與水的混合溶液進行浸提［19－21］。為了防止分析物的分解或氧化，通常在4℃甚至更低溫度下進行［11，19］，且浸提液中需加入少量的酸類化合物。如改良的 Bieleski溶劑［22］，采用甲醇/甲酸/水(15∶1∶4，v/v/v)的溶液進行浸提，可同時萃取生長素、細胞分裂素、脫落酸和茉莉酸。Pan等［3］采用異丙醇/水/濃鹽酸(2∶1∶0.002，v/v/v)的溶液對水稻葉進行浸提，再用液液萃取除雜，通過液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用建立了赤霉素(gibberellin 3(GA3)和gibberellin 4(GA4))、吲哚乙酸、脫落酸、水楊酸和茉莉酸等18種內(nèi)源性有機酸類植物激素的檢測方法。另外還有報道通過旋蒸除去有機相，再進行凍融來除去大部分的脂溶性色素或蛋白［7，20］。

1.2 純化與富集

由于植物基質(zhì)的復雜性，在進行色譜分析前，通常都需要對浸提液進行純化或富集。純化富集的方法通常有固相萃取、固相微萃取、液相萃取和液相微萃取等。

1.2.1 固相萃取

固相萃取(solid phase extraction，SPE)是運用最為廣泛的樣品純化除雜方法。根據(jù)弱酸類植物激素的極性進行純化，常用的固相萃取柱為C18柱、親水親油平衡柱(Oasis HLB)等［12，23］。C18 柱可以除去大量非極性的葉綠素基質(zhì)，同時也可以通過調(diào)節(jié)淋洗液和洗脫液來除去一些極性很強的基質(zhì)。但其除雜能力有限，當植物中含有大量非極性基質(zhì)時常常會產(chǎn)生很大的基質(zhì)干擾峰。所以單純采用C18柱僅僅能適用于一些基質(zhì)不太復雜的樣品。如Ma等［24］采用C18柱對椰汁進行除雜，聯(lián)用液相色譜/質(zhì)譜可同時對生長素、脫落酸、赤霉素進行檢測，回收率可達到67%～95%。Oasis HLB是一種親水親油平衡柱，盡管其極性較大，但單獨使用也難以達到滿意的凈化效果。通常將它與液液萃取等方法聯(lián)用來提高除雜效率［25］。根據(jù)弱酸類植物激素的酸堿性，近年來有人將離子交換作用引入到純化過程中。Ge等［26］采用一根反相和陰離子交換混合機制的固相萃取柱(OasisMAX)對椰汁中的11種赤霉素進行了萃取，可達到500倍左右的富集倍數(shù)和80%左右的回收率。為進一步提高選擇性，一些高選擇性的材料也被用于植物激素的萃取，如分子印跡材料［27，28］。Yan 等［28］采用分子印跡技術對香蕉中的生長素進行了測定，萃取相對回收率為78%～107%，體現(xiàn)了萃取方法較好的選擇性。

很多時候，單根柱的萃取方法難以處理復雜的植物組織提取液，因此多種小柱串級萃取方法的應用更為廣泛［12，29］，C18 與 OasisMAX 聯(lián)用萃取、Oasis HLB 與 C18聯(lián)用［30］、Oasis HLB 與 OasisMAX 聯(lián)用［13，23］都有報道。

近年來發(fā)展起來的基質(zhì)固相分散萃取(matrix solid-phase dispersion，MSPD)是一種用于固體和黏稠液體樣品的前處理技術［31］，它實際上是把前面提及的固相萃取過程和浸提過程同時進行，使得提取和凈化步驟合二為一［32］。MSPD首先利用機械混合研磨時產(chǎn)生的剪切力使樣品破裂完全，加快溶出、提取，再利用樣品基質(zhì)與化學固定相選擇性相互作用得到初步分離。它將樣品基質(zhì)與固定相材料混合研磨，并填裝到固相萃取柱中，再用溶劑將分析物洗脫。該法具有簡便、靈活、快速、低耗等優(yōu)點，已被廣泛應用于藥物［33］、農(nóng)藥［34］、天然成分以及復雜植物［35］和動物［36］樣品分析。我組將MSPD 用于擬南芥樣品中赤霉素分析的前處理，并結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)進行檢測，建立了MSPDHPLC-MS/MS測定擬南芥中痕量赤霉素GA1、GA3和GA4的分離檢測方法，且成功地用于擬南芥地上部分中GA1、GA3和 GA4的測定［37］。其處理流程如圖2所示:首先將擬南芥樣品與C18填料混合研磨制成MSPD柱，并采用80%冷甲醇洗脫。然后采用反相C18色譜柱進行分離，以0.05%甲酸水溶液和乙腈為流動相進行梯度洗脫，采用電噴霧(electrospray ionization，ESI)負離子模式電離，多反應監(jiān)測模式檢測。對樣品前處理條件、色譜分離條件和質(zhì)譜檢測條件進行了優(yōu)化，結(jié)果表明，在最優(yōu)條件下，3種赤霉素在10～300 ng/g范圍內(nèi)呈良好線性，相關系數(shù)(r)均大于0.99，檢出限在1.1～4.1ng/g之間。在10～50 ng/g添加水平下，平均回收率范圍為54.7%～102.6%，相對標準偏差(relative standard deviation，RSD，n=3)在3.2% ～12.8%之間。該方法操作簡單、靈敏度高、選擇性好、回收率高，適合擬南芥中GA1、GA3、GA4的含量測定。

圖2 基質(zhì)固相分散處理植物樣品分析赤霉素的示意圖Fig.2 Schematic illustration of MSPD method for analysis of gibberellins in plant sample

1.2.2 固相微萃取

固相微萃取(solid phase microextraction，SPME)是一種微型化的固相萃取方法，樣品富集和純化可同時完成，具有較大的富集能力。其溶劑消耗量少，是一種綠色環(huán)保的萃取方法［38］。但固相微萃取的樣品回收率過低，通常不到60%，對于微量存在于植物中的激素需要大量的植物樣品進行富集［39］。而且由于萃取材料容量過低，需要材料有較高選擇性，否則由于基質(zhì)效應，萃取回收率會大幅降低，所以早期應用于基質(zhì)復雜和含量低的植物激素前處理上的研究較少。但近年隨著質(zhì)譜檢測靈敏度的逐步提高，也開始有一些應用報道。如Liu等［40］采用商品化的Carbowax涂層的固相微萃取柱對吲哚乙酸和脫落酸等激素進行了選擇性萃取。Liu等［18］采用(2-丙烯酰胺基-2-甲基-1-丙磺酸)-(乙烯基二甲基丙烯酸)共聚物(poly(AMPS-co-EDMA))合成的整體毛細管柱直接分離植物組織中的細胞分裂素，其萃取回收率在標樣中可達95%以上，但在實際樣品中僅能達到59.1%～77%?？梢娖浠|(zhì)效應較大。

1.2.3 液相萃取

液相萃取在傳統(tǒng)方法中通常與固相萃取聯(lián)用來提高純化效果［4，8，12，41］。但隨著質(zhì)譜檢測靈敏度和選擇性的提高，也有直接對液液萃取后的提取液進行質(zhì)譜檢測的報道。Pan等［3］采用二氯甲烷對浸提液進行液液萃取除雜后就直接進行液相色譜/質(zhì)譜檢測，但檢測到的激素只是含量較高的生長素、脫落酸、茉莉酸等。

1.2.4 液相微萃取

以上的討論表明:對于基質(zhì)復雜(如植物組織)且含量低的酸性植物激素(如赤霉素)，單級固相萃取或微萃取純化方法難以滿足痕量植物激素分析檢測的需求。其實，大部分固相萃取材料都以疏水作用為主導，即使引入離子交換或使用分子印跡材料，材料上的有機官能團也會帶來較大的疏水非特異性作用，這樣對植物中大量的脂質(zhì)和色素的去除很不利。而傳統(tǒng)的多級固相微萃取又具有步驟多、繁瑣耗時的缺陷。液液液微萃取方法是一種將液相萃取和反萃取結(jié)合的微型液相萃取方法。它以樣品相和接受相的pH梯度為傳質(zhì)動力，中間有機相的組成決定萃取選擇性，非常適合于萃取有電離能力的有機化合物［42］。近年來中空纖維膜的引入使得這種方法可以達到與固相微萃取相近的穩(wěn)定性，應用更為簡便［43－46］。Wu 等［47］將中空纖維膜液液液微萃取(hollow fiber-based liquid-liquid-liquid micro extaction，HF-LLLME)應用到椰子汁中水楊酸、茉莉酸、吲哚乙酸、脫落酸的萃取，絕對回收率在8%～43.7%，富集倍數(shù)為48～243倍。但作為一種微萃取方法，其回收率過低的問題非常突出，所以并不適合樣品量有限的植物樣品前處理，僅適合這類樣品量大的果汁樣品。

我組發(fā)展了水滲透增強中空纖維膜液液液微萃取方法，并應用于赤霉素的萃取分析［48］。水滲透過程由提供相(即樣品相)和接受相之間的離子強度差造成。接受相內(nèi)水向外滲透同時濃縮了分析物，進一步增加了富集倍數(shù)并最終突破平衡常數(shù)，其原理如圖3a所示［48］。將這種改進的液液液微萃取應用到赤霉素萃取富集中，首先將植物的80%甲醇浸提液經(jīng)抽濾、旋蒸、冷凍、離心處理后作為液液液微萃取的供給相，采用中空纖維微濾膜孔中充滿的有機溶劑作為有機相，膜的內(nèi)腔注入堿性水溶液作為接受相，將膜放入處理后的植物浸提液中進行萃取［7］。裝置如圖3b所示。我們采用單因素實驗法對中空纖維膜中有機相組成和樣品相鹽度進行了優(yōu)化，采用正交試驗對提供相和接受相pH值、萃取溫度進行了優(yōu)化，通過傳質(zhì)模擬對萃取時間和接受相體積進行了優(yōu)化。將優(yōu)化后的條件作為最優(yōu)的方法測定了水稻中的8種赤霉素，提高了萃取方法對赤霉素類化合物的選擇性。結(jié)果表明，對不同赤霉素，萃取富集倍數(shù)為100～800倍不等，萃取回收率在10%～80%之間［7］。對8種赤霉素的檢測限可達1.6～61 pg/mL，相對標準偏差在10%以下。采用這種方法檢測了不同時期的水稻樣品中8種赤霉素的含量。

現(xiàn)在很多全自動的固相萃取或微萃取儀都已商品化，但由于液相微萃取的穩(wěn)定性較差，其通量和自動化研究不多，商品化極少。

圖3 水滲透液液液微萃取(a)傳質(zhì)過程示意圖［48］和(b)裝置示意圖Fig.3 (a)Schematic description of mass transfer process［48］ and(b)the device of HF-LLLME with water osmosis

2 油菜素甾醇

油菜素甾醇類化合物是植物體內(nèi)調(diào)控植物生長的一類相當重要的植物激素［6］。其分子結(jié)構(gòu)如圖4所示，其物理化學性質(zhì)見表1。但它的檢測難度更大。首先，其含量極低(成熟的莖和葉中僅0.01～0.1 ng/g鮮重［6］)，另外，缺乏具有高靈敏檢測響應的特征官能團［6，9］。即使在靈敏度和選擇性極高的液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用分析儀上，由于它沒有可電離基團，在電噴霧離子源上的響應仍相當微弱。Gamoh等［49］首次采用大氣壓化學電離源(atmospheric pressure chemical ionization，APCI)對萘硼酸衍生化的油菜素甾醇進行檢測，僅能達到2～4 ng的檢測限。Swaczynova等［10］采用ESI離子源對油菜素甾醇進行檢測，對幾種特殊的油菜素甾醇類化合物能達到50 fmol(約25 pg)的檢測限。為了進一步提高檢測靈敏度，多采用衍生法來提高油菜素甾醇對于不同檢測器的響應。但目前適合于液相色譜分析的前處理方法還很少，且存在很多問題［50－52］。主要是因為常規(guī)前處理方法沒有足夠的選擇性，油菜素甾醇回收率低、雜質(zhì)殘余多、基質(zhì)效應大，難以滿足極低濃度分析物的檢測要求。

2.1 樣品提取

和前面的酸性植物激素不同，油菜素甾醇的極性比較小，通常采用80%的甲醇-水溶液在4℃進行浸提［51，53，54］。也有文獻采用純的甲醇或乙腈進行浸提［52，55，56］。

2.2 純化與富集

2.2.1 固相萃取

油菜素甾醇處于中極性區(qū)，植物色素和脂肪酸的干擾更加嚴重，要求除雜更加徹底。傳統(tǒng)樣品前處理方法需要經(jīng)過兩步以上的液相萃取，再用串級固相萃取來達到純化的目的［51，57－59］。近年來，由于新的固相萃取材料的引入，這個過程得以少許簡化。Xin等［54］采用反相陰離子交換混合機制柱(MAX)和反相陽離子交換混合機制柱(MCX)進行兩級SPE，除去大量的可電離化合物，得到的中性化合物再用硼酸鍵合的磁性納米球除去糖類中性化合物，測定的brassinolide(BL)和castasterone(CS)兩種油菜素甾醇的回收率達70%左右，硼酸磁性納米球除去糖類后，基質(zhì)效應大大減小，靈敏度提高了5倍。

圖4 油菜素甾醇類化合物的結(jié)構(gòu)Fig.4 Structures of brassinosteroids

雖然串級的固相萃取柱可以有較高的回收率，但這種基于除雜的純化方法往往有較大的基質(zhì)效應，而且過程繁瑣、損失也大。于是有人利用具有更強選擇性的固相萃取材料，如分子印跡或親和材料對油菜素甾醇進行選擇性萃取，同時一步排除雜質(zhì)［52，56］。早在 1994 年，Gamoh 等［52］就采用硼酸親和凝膠(affin601)對植物提取液中的油菜素甾醇進行選擇性萃取，萃取回收率可達90%以上，但其由于相互作用太強使得洗脫非常困難，需要向洗脫液中加入5%的過氧化氫才能洗脫90%，之后很少有人使用這種方法。

2.2.2 固相微萃取

對于油菜素甾醇類的萃取純化來說，采用固相微萃取方法的研究并不多，這主要是由于其含量太低，樣品絕對回收率必須很高才能檢出。Pan等［60］采用丙烯酰胺-乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物(poly(acrylamide-co-ethylene glycol dimethacrylate)，poly(AM-co-EGDMA))涂層修飾的固相微萃取纖維針對油菜素甾醇進行萃取，證明聚合物涂層對油菜素甾醇有一定的選擇性，相對回收率在70%～104%，并檢測到花粉中的油菜素甾醇(0.6～1.9 μg/g)。

2.2.3 在線微固相萃取

為了進一步提高油菜素甾醇萃取方法的選擇性和萃取效率，利用油菜素甾醇的鄰二羥基與硼酸之間的親和作用以及其較強的疏水作用，本課題組［56］發(fā)展了一個具有二維機制的油菜素甾醇在線微固相萃取(two dimensional online micro solid phase extraction，2D-online μSPE)前處理方法。將親和填料與疏水填料串聯(lián)，親和填料通過親和基團與BRs分子中的鄰二羥基基團發(fā)生親和作用，而疏水填料則通過疏水鏈與BRs分子中的碳環(huán)發(fā)生疏水作用。這兩種填料完全不同的作用機制和作用位點使得它們有很好的正交性，因此兩種填料分段填充的SPE微柱對BRs具有很高的選擇性。另外，疏水填料在硼酸填料后端，對BRs與親和填料強親和作用而產(chǎn)生的寬洗脫譜帶，在疏水填料段被壓縮在端頭區(qū)，然后置換沖洗溶液，壓縮餾分的譜帶，達到高倍數(shù)富集。其作用原理如圖5所示。同時兩種填料的對接可實現(xiàn)第一維填料洗脫的同時就是對第二位填料的上樣，省去多級串聯(lián)SPE小柱操作的繁瑣性和損失，實現(xiàn)在線全自動化的處理。

圖5 在線二維微固相萃取-在柱衍生前處理系統(tǒng)對油菜素甾醇分析的原理圖［56］Fig.5 Schematic drawing of 2D-online μSPE for brassinsteroid analysis［56］

該裝置可以實現(xiàn)在30 min內(nèi)完成植物粗提液的選擇性萃取和富集，并在線衍生，最后通過中心切割給液相色譜上樣。這套體系與液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用，對檢測的5種油菜素甾醇(BL，CS，6-deoxo-24-epicastasterone (d-epiCS)，teasterone(TE)和 typhasterol(TY))的檢測限達到 0.1 pg/mL。另外，此方法定量相當準確，且基質(zhì)效應極小。因此可以直接用外標法定量，避免采用標準加入法而浪費植物樣品，也不需要使用同位素標準品控制基質(zhì)效應。外標法測定的相對回收率在80%～120%之間，RSD小于10%。與HPLC-MS/MS聯(lián)用，番茄葉中的5種油菜素甾醇均能檢出，檢出和加標譜圖如圖6所示。

2.3 衍生反應

油菜素甾醇結(jié)構(gòu)中既沒有紫外響應的芳香基團或共軛基團，也沒有ESI源響應的可電離基團，更沒有熒光響應基團，因此化學增敏衍生對于油菜素甾醇化合物的檢測必不可少。近年來油菜素甾醇衍生方法的研究較多，大多基于硼酸與油菜素甾醇結(jié)構(gòu)中的鄰二羥基之間的特異性反應。Svatos等［61］采用丹磺酰氯-3-氨基苯硼酸(dansyl-3-aminophenylboronate)對油菜素甾醇進行衍生，其在ESI源下的標樣檢測限能達到0.1 pg。Huo等［53］開發(fā)了一種新的衍生試劑2-溴吡啶-5-硼酸(2-bromopyridine-5-boronic acid)，對油菜素甾醇進行衍生，衍生過程比以前的方法更為簡單，不需要加熱和長時間的反應，僅需數(shù)秒鐘振搖即可完成衍生反應，達到2～8 pg/mL的檢測限。Xin等［54］采用6-甲氧基-3吡啶硼酸(6-methoxy-3-pyridinylboronic acid，MPyBA)對油菜素甾醇進行衍生，其在標樣中的檢測限為1 pg左右。

以上衍生反應都在試管內(nèi)進行，難以在線應用，且在線過程中也會存在譜峰擴散或溶劑不兼容的問題。結(jié)合前面提到的二維固相微萃取前處理裝置，我們組［56］發(fā)展了一種對油菜素甾醇進行柱上衍生的方法。我們采用氨基苯硼酸作為衍生試劑，在二維SPE的C18柱區(qū)段上在柱衍生，然后柱上洗脫，進樣閥定量環(huán)中心切割衍生產(chǎn)物，最后轉(zhuǎn)閥將純化濃縮衍生后的BRs進樣給HPLC。這種在柱衍生的方法，可以實現(xiàn)衍生試劑的在線濃縮，當采用同樣濃度衍生試劑時，在柱衍生比在管衍生的靈敏度提高了3～10倍。當與前面的二維SPE在線系統(tǒng)連接時，其檢測限可達0.1 pg/mL。

圖6 在線二維微固相萃取-在柱衍生前處理系統(tǒng)分析番茄葉中5種油菜素甾醇的色譜圖(225 mg番茄葉組織，浸提液10 mL)［56］Fig.6 Chromatograms of tomato leaf samples(225 mg tissues for each 10 mL sample)after online 2D μSPE-on column derivatization-HPLC-MS/MS analysis［56］

3 植物多肽

植物多肽［62，63］是近20年來才逐步被人關注的一類植物激素。研究表明，一些植物多肽同樣參與了植物生長發(fā)育的調(diào)控以及細胞間的信號傳導。多肽激素包括系統(tǒng)素(systemin)、植物硫肽素、S位點富含半胱氨酸蛋白/S位點蛋白質(zhì)11(S-locus cysteine-rich protein/S-locus protein 11，SCR/SP11)、基因CLAVATA3(CLV3)以及快速堿化因子等［63］。其中僅系統(tǒng)素［64，65］的前處理方法研究較多。

系統(tǒng)素是植物受到外界傷害時在細胞質(zhì)中產(chǎn)生的具有信號傳導功能的內(nèi)源多肽物質(zhì)，也是目前植物傷害生理這一新領域研究中最關鍵的因素［17］。其化學結(jié)構(gòu)包括18個氨基酸，為一類極性很強的兩性化合物，對其提取和純化的方法與前面提到的有機酸類和甾醇類有較大差別。

3.1 樣品提取

由于多肽的強極性和兩性，其提取通常采用純的蒸餾水就可以進行［11］。對于含水量較多的樣品通常直接勻漿過濾就可以進行純化。

3.2 純化與富集

植物多肽具有強極性和兩性特點，常用二乙基氨基乙基纖維素(diethylaminoethyl cellulose，DEAE)柱純化，也有使用強陽離子交換柱與C18柱進行多級萃取的報道［66－69］。同時由于蒸餾水提取，提取液中通常含有大量大分子蛋白，常需用葡聚糖凝膠G25(Sephadex G25)進行過濾除雜。

近年來，Liu等［64］采用免疫親和柱首次對系統(tǒng)素進行了選擇性分離，采用液相色譜-四極桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜(quadrupole coupled of time of flight mass spectrometry，QTOFMS)進行檢測。免疫親和柱是將抗番茄系統(tǒng)素的多克隆抗體共價鍵合到CNBr活化的瓊脂糖凝膠上，將鍵合好的吸附劑填充到SPE小柱中進行萃取，萃取結(jié)果表明該材料對番茄系統(tǒng)素有較高的選擇性，實際樣品加標回收率能達到90%左右，而對比馬鈴薯系統(tǒng)素I和II則選擇性很差，加標回收率僅30%～50%。

表2總結(jié)了3類植物激素近年來主要發(fā)展的樣品前處理方法。

4 總結(jié)與展望

隨著色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術的發(fā)展，前處理方法會變得更加簡便。簡便、綠色和快速是樣品前處理方法的主要追求目標，新穎的前處理方法以及新型的萃取材料和衍生試劑正在不斷涌現(xiàn)。

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但這些新方法、新材料的真正應用價值仍有待檢驗。一是某些新方法雖然實現(xiàn)了針對某些樣品和某些分析物的簡便快速綠色的前處理，但主要是基質(zhì)不太復雜的樣本(果汁等)，而且其目標化合物往往是植物中含量比較高的組分(某些酸性植物激素)。其實對于真正具有檢測難度的分析物以及樣品，則往往仍達不到分析要求。二是某些新方法雖然較傳統(tǒng)方法有了更簡便的操作過程，或更高的選擇性，但其整個處理流程和形式仍沒有太大突破;對于植物組織樣品，液氮研磨、低溫儲藏以及長時間的浸提過程仍是必須的。但植物組織破碎、浸提等過程不僅僅耗時長，而且使得檢測結(jié)果難以真正體現(xiàn)植物激素在植物活體內(nèi)的空間分布以及時間動態(tài)變化，更不能區(qū)分激素在植物基質(zhì)中的存在狀態(tài)(如游離態(tài)或結(jié)合態(tài))，使得分析方法與植物學檢測的前沿需求仍然相距甚遠。三是植物學研究通常需要同時測定很多樣本，因此分析方法的通量和方法檢測精密度仍有待提高。而一些新的萃取材料，如固相微萃取材料通常著重于考察選擇性回收率等參數(shù)，而缺乏萃取材料制作重復性、方法重現(xiàn)性研究，以及與傳統(tǒng)商品化材料的系統(tǒng)比較。

針對植物激素分析需求，筆者認為在以下幾個方面應繼續(xù)展開深入研究:一是對于基質(zhì)復雜、含量低的植物激素分析，如植物組織葉、莖等部位的油菜素甾醇，應進一步提高樣品前處理方法的效率和選擇性，以達到少量、微量樣品的分析要求。二是針對植物學上對檢測分析的前沿需求，發(fā)展一些針對活體樣品、具有時空分辨率的前處理方法，拓展樣品前處理領域。如近年來發(fā)展的原位固相微萃取方法，具有很好的活體樣品前處理的潛力。三是針對激素在植物組織中的存在狀態(tài)，發(fā)展一些新的材料或方法，實現(xiàn)植物激素的形態(tài)分析，如蛋白結(jié)合的植物激素和游離態(tài)的植物激素。

總之，對于超低含量基質(zhì)復雜的植物激素的準確、快速、簡便的分析，以及活體原位植物激素的動態(tài)分析問題，仍然是現(xiàn)在植物激素分析的挑戰(zhàn)。而這些問題的解決都離不開前處理技術的深入發(fā)展。植物激素定量分析水平的進步，也將推動植物激素相關的植物學基礎研究的發(fā)展。

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