刀豆蛋白A誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)p-ERK1/2

龔文廣，王紅梅，牛青霞

(汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院炎癥與免疫性疾病研究所及病理生理學(xué)教研室，廣東 汕頭 515041)

刀豆蛋白A誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)p-ERK1/2

龔文廣，王紅梅，牛青霞

(汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院炎癥與免疫性疾病研究所及病理生理學(xué)教研室，廣東 汕頭 515041)

目的探討刀豆蛋白A(ConcanavalinA，ConA)對(duì)CRL2480細(xì)胞(人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系)細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(Extracellular signal-regulated kinase，ERK)1/2磷酸化的影響。方法采用MTT法檢測(cè)ConA對(duì)CRL2480細(xì)胞活化的影響；采用Western印跡法檢測(cè)CRL2480細(xì)胞磷酸化(p)-ERK1/2的表達(dá)；采用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)p-ERK1/2在細(xì)胞內(nèi)的分布。結(jié)果在5～20 μg/ml范圍，ConA刺激CRL2480細(xì)胞8 h的活化指數(shù)具有劑量依賴性；20 μg/ml ConA顯著增加CRL2480細(xì)胞的活化(P＜0.05)。ConA能夠增加CRL2480細(xì)胞的p-ERK1/2表達(dá)水平(P＜0.05)，ERK途徑抑制劑PD98059和U0126明顯抑制p-ERK1/2表達(dá)。免疫熒光染色結(jié)果顯示ConA刺激細(xì)胞的熒光信號(hào)明顯高于對(duì)照細(xì)胞，熒光分布于細(xì)胞漿、細(xì)胞核周圍和細(xì)胞核內(nèi)。結(jié)論ConA能夠激活CRL2480細(xì)胞表達(dá)p-ERK1/2。

刀豆球蛋白A；內(nèi)皮細(xì)胞；細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶

刀豆蛋白A又稱伴刀豆球蛋白A(Concanavalin A，ConA)，是從巨刀豆中提取的一種植物凝集素，為四聚體蛋白，可以與生物大分子末端的α-D-甘露糖基以及α-D-葡萄糖基結(jié)合[1]。因小鼠模型中，ConA肝損傷的某些病理變化類同與人肝炎的病理特點(diǎn)，據(jù)此ConA肝損傷常被用于研究人的肝臟疾病[2]。尾靜脈注射的ConA主要結(jié)合于肝內(nèi)皮細(xì)胞[3]。另外，ConA與腫瘤免疫細(xì)胞的激活和腫瘤新生血管密切相關(guān)[1]，被視為新的抗腫瘤策略。血管內(nèi)皮細(xì)胞位于血管的內(nèi)表面，不斷受到血源性因素刺激，積極參與炎癥、凝血和血管新生等病理生理過(guò)程。因此，我們認(rèn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞在ConA相關(guān)的反應(yīng)中起重要作用。細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(Extracellular regulated proteinkinases，ERK)是一類絲氨酸/蘇氨酸(Serine/ threonine，Ser/Thr)蛋白激酶，包括ERK1和ERK2(統(tǒng)稱為ERK1/2)。ERK1/2信號(hào)途徑屬于絲裂原活化蛋白激酶家族(Mitogen activated protein kinase，MAPK)家族，能夠被生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、絲裂原等諸多因素激活，調(diào)節(jié)細(xì)胞功能(如增殖、遷移和表達(dá)炎癥介質(zhì))，與炎癥、腫瘤及血管性疾病密切相關(guān)[4-5]。本研究采用CRL2480細(xì)胞(人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系)為細(xì)胞研究模型，觀察ConA及ERK信號(hào)途徑抑制劑(PD98059和U0126)對(duì)磷酸化(p)-ERK1/2分子表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料、儀器和培養(yǎng)液 CRL2480細(xì)胞系購(gòu)自ADCC(美國(guó))；胎牛血清(FBS)、胰胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒添加物(ITS)、M199培養(yǎng)液、谷氨酰胺和抗小鼠Cy3熒光抗體購(gòu)自Invitrogen公司(美國(guó))，內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)添加物(ECGS)購(gòu)自EMD Bio-sciences公司(美國(guó))；肝素、ConA、青霉素-鏈霉素、噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自Sigma公司美國(guó))；ERK信號(hào)CASE試劑盒(包括抗 p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)、抗-ERK1/2 (Thr202/Tyr204)、二抗及各種緩沖液)購(gòu)自SuperArray公司(美國(guó))；PD98059和U0126購(gòu)自Calbiochem公司(美國(guó))；抗β微管蛋白抗體購(gòu)自CST公司(美國(guó))；細(xì)胞裂解液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所(中國(guó))，丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺混合物(1:29)購(gòu)自Bio-Rad公司；PVDF膜購(gòu)自Millipore公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自Promega公司(美國(guó))。主要儀器包括倒置熒光顯微鏡(Olympus公司，日本)、CO2培養(yǎng)箱(Kendro公司，德國(guó))、生物安全柜購(gòu)自(Heal force公司，中國(guó))、離心機(jī)(Eppendorf公司，美國(guó))、電泳儀和半干轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad公司，美國(guó))、掃描儀(Amersham公司，美國(guó))和酶標(biāo)儀(Molecular Devices公司，美國(guó))。完全培養(yǎng)液包括12.5 μg/ml ECGS，100 μg/ml肝素、10%FBS、2 mmol/L谷氨酰胺、10 mmol/L Hepes和M199培養(yǎng)液，無(wú)血清培養(yǎng)液包括不含血清的完全培養(yǎng)液和1%ITS，12.5%聚丙烯酰胺凝膠、凝膠電泳及轉(zhuǎn)膜緩沖液按分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[6]配制。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) CRL2480細(xì)胞培養(yǎng)于完全培養(yǎng)液中，密度約90%時(shí)，胰蛋白酶消化、傳代，3～4 d傳代1次。

1.3 MTT法檢測(cè)CRL2480細(xì)胞活性 將CRL2480細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，密度約80%。將完全培養(yǎng)液換為無(wú)血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)過(guò)夜。分別用5 μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml ConA刺激細(xì)胞30 min和8 h。加2.5 mg/ml MTT，20 μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸棄培養(yǎng)上清，加二甲亞砜150 μl/孔，570 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度值。復(fù)孔6個(gè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。細(xì)胞活化指數(shù)= ConA刺激細(xì)胞的A570值/對(duì)照細(xì)胞的A570值。

1.4 Western印跡法檢測(cè)p-ERK ①樣品制備：完全培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞至密度為80%，換為無(wú)血清培養(yǎng)液，過(guò)夜。PD98059和U0126預(yù)處理細(xì)胞30 min，20 μg/ml ConA刺激細(xì)胞15 min，對(duì)照細(xì)胞組不加ConA。吸棄培養(yǎng)液，加入裂解液，冰上裂解30 min，收集細(xì)胞裂解液。4℃下，離心8 000 r/min×15 min，收集上清。②12.5%SDS-PAGE分離蛋白：按分子克隆實(shí)驗(yàn)指南操作[6]。煮沸樣品5 min，20 μl/孔。80 V 1 h，100 V 2 h。③半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移蛋白：20%甲醇緩沖液作用PVDF膜10 min。在半干轉(zhuǎn)膜儀板上，依次放置濾紙、電泳后凝膠、甲醇處理的PVDF膜和濾紙，加蓋。15 V 1 h。④處理含目的蛋白的PVDF膜：封閉緩沖液封閉PVDF膜1 h，洗滌緩沖液洗膜3次，5 min/次。分別加抗p-ERK1/2和抗-ERK1/2抗體(1:1 000)，4℃孵育過(guò)夜，洗膜3次。加二抗(1:100)，1 h/室溫，洗膜3次。⑤結(jié)果視化和半定量處理：按試劑說(shuō)明書(shū)，加發(fā)光液，曝光、顯影、定影、掃描，ImageJ軟件半定量分析顯色條帶。⑥PD98059和U0126濃度選擇：0 μmol/L、25 μmol/L和50 μmol/L PD98059，0 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L U0126、ConA對(duì)照以及溶劑(二甲亞砜)對(duì)照預(yù)處理CRL2480細(xì)胞30 min，20 μg/ml ConA刺激細(xì)胞15 min，進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，因50 μmol/L PD98059和10 μmol/L U0126幾乎完全抑制ConA誘導(dǎo)的p-ERK1/2表達(dá)。因此，將他們用于本研究。

1.5 細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè) p-ERK1/2 將CRL2480細(xì)胞接種于培養(yǎng)孔中，完全培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)過(guò)夜。50 μmol/L PD98059和10μmol/LU0126預(yù)處理細(xì)胞30 min后，20μg/ml ConA處理細(xì)胞15 min，PBS洗細(xì)胞3次。固定、通透、洗細(xì)胞，封閉緩沖液封閉非特異性位點(diǎn)1 h。加抗p-ERK1/2抗體，4℃孵育過(guò)夜。洗細(xì)胞，加cy3標(biāo)記的抗小鼠熒光二抗結(jié)合物(1:800)，室溫避光孵育30 min，洗細(xì)胞。Hochest3342(1:3 000)染細(xì)胞核，洗細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察、拍照。

2 結(jié) 果

2.1 ConA對(duì)CRL2480細(xì)胞活化的影響 MTT法檢測(cè)表明：在5～20 μg/ml范圍內(nèi)，ConA處理8 h，CRL2480細(xì)胞的活化具有劑量依賴性；20 μg/ml ConA顯著增加CRL2480細(xì)胞的活化指數(shù)(P＜0.05)。因此，20 μg/ml ConA被用于進(jìn)一步研究。ConA處理細(xì)胞30 min，各劑量組間活化指數(shù)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 ConA對(duì)CRL2480細(xì)胞活化指數(shù)的影響(n=4)

2.2 PD98059和U0126對(duì)CRL2480細(xì)胞活化的影響 ConA處理CRL2480細(xì)胞8 h的MTT結(jié)果表明：①ConA處理細(xì)胞的活化指數(shù)高于對(duì)照細(xì)胞(P＜0.05)；②50 μmol/L PD98059和10 μmol/L U0126組的活化指數(shù)與細(xì)胞對(duì)照組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)：③50 μmol/L PD98059+ConA和10 μmol/L U0126+ConA組細(xì)胞的活化指數(shù)低于ConA組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。ConA處理CRL2480細(xì)胞30 min，各觀察組間活化指數(shù)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。這提示MTT法的靈敏度不足以反映PD98059和U0126對(duì)ConA作用的抑制效應(yīng)。

2.3 ConA誘導(dǎo)p-ERK表達(dá) Western印跡法結(jié)果表明：20 μg/ml的ConA刺激CRL2480細(xì)胞15 min，p-ERK1/2表達(dá)水平明顯高于對(duì)照細(xì)胞(P＜0.05)；50 μ mol/L PD98059和10 μmol/L U0126顯著抑制ConA誘導(dǎo)的p-ERK1/2表達(dá)水平(P均＜0.05，圖2A，2B)。免疫熒光染色顯示：ConA處理細(xì)胞的熒光信號(hào)明顯高于對(duì)照細(xì)胞；熒光斑點(diǎn)分布于細(xì)胞漿、細(xì)胞核周圍和細(xì)胞核內(nèi)；PD98059和U0126預(yù)處理細(xì)胞的熒光信號(hào)明顯減弱(圖2C)。

圖2 ConA對(duì)p-ERK1/2表達(dá)的影響(n=4)

3 討論

采用蛋白酪氨酸磷酸酶2(SHP2)野生型和突變型成纖維細(xì)胞，研究信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)發(fā)現(xiàn)：通過(guò)SHP2-ras-ERK和SHP2-ras-p38途徑，ConA刺激細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-2分泌[7]；ConA通過(guò)SHP2-MEK1-ERK途徑，ConA促進(jìn)細(xì)胞分泌金屬蛋白酶組織抑制劑-2[8]。Zhao等[9]在細(xì)胞表面糖蛋白PZR的研究中發(fā)現(xiàn)：ConA刺激HT-1080，293和HeLa細(xì)胞，可以引起細(xì)胞表面PZR酪氨酸磷酸化，激活SHP2和細(xì)胞凝集反應(yīng)。Roy等[9]報(bào)道ConA通過(guò)MEK/ERK途徑，激活HeLa細(xì)胞的自噬作用。我們用ConA處理CRL24808細(xì)胞8 h，該細(xì)胞活化水平升高。Western印跡法結(jié)果表明ConA能夠增加CRL2480細(xì)胞的p-ERK1/2分子表達(dá)。采用抗p-ERK1/2抗體染色的結(jié)果顯示：ConA處理細(xì)胞的熒光強(qiáng)度顯著高于對(duì)照細(xì)胞；熒光分布于細(xì)胞漿、細(xì)胞核周圍及細(xì)胞核內(nèi)；ERK途徑抑制劑PD98059和U0126顯著降低ConA誘導(dǎo)的p-ERK1/2水平。這表明ConA能夠激活CRL2480細(xì)胞的ERK信號(hào)途徑。當(dāng)用ConA和層粘連蛋白刺激小鼠腹水肝癌細(xì)胞，可以引起微絲在細(xì)胞膜下重新組裝，并且促進(jìn)DNA合成，提示微絲在信號(hào)分子從細(xì)胞膜運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核中起關(guān)鍵作用[11]。胡良高等[12]研究表明ConA與巨噬細(xì)胞膜受體結(jié)合后，加速膜下肌動(dòng)蛋白多聚化，微絲走向從細(xì)胞膜延伸到細(xì)胞中央。本研究中：內(nèi)皮細(xì)胞漿內(nèi)的紅色絲狀熒光物質(zhì)，可能與p-ERK1/2附著在微絲上面有關(guān)；細(xì)胞核周圍的熒光信號(hào)可能與細(xì)胞漿p-ERK1/2向細(xì)胞核內(nèi)移動(dòng)、聚集有關(guān)。據(jù)此，我們認(rèn)為ConA能夠通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞膜表面的結(jié)合位點(diǎn)，引起細(xì)胞漿的p-ERK1/2分子表達(dá)升高。p-ERK1/2進(jìn)入細(xì)胞核，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄、mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)(圖3)。

圖3 ConA激活CRLl2480細(xì)胞ERK信號(hào)途徑模式圖

綜上所述，ConA能夠激活CRL2480細(xì)胞表達(dá)p-ERK1/2，提示干預(yù)ERK的活化有利于調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞和血管的功能。

[1]Li WW,Yu JY,Xu HL,et al.Concanavalin A:a potential anti-neoplastic agent targeting apoptosis,autophagy and anti-angiogenesis for cancer therapeutics[J].Biochem Biophys Res Commun,2011, 414(2):282-286.

[2]Zhou YC,Chen S,Cao JJ,et al.Adenovirus-mediated viral interleukin-10 gene transfer prevents concanavalin A-induced liver injury [J].Dig Liver Dis,2012,44(5):398-405.

[3]Knolle PA,Gerken G,Loser E,et al.Role of sinusoidal endothelial cells of the liver in concanavalin A-induced hepatic injury in mice [J].Hepatology,1996,24(4):824-829.

[4] Kohno M,Tanimura S,Ozaki K.Targeting the extracellular signal-regulated kinase pathway in cancer therapy[J].Biol Pharm Bull,2011,34(12):1781-1784.

[5] Chu X,Ci X,He J,et al.A novel anti-inflammatory role for ginkgolide B in asthma via inhibition of the ERK/MAPK signaling pathway[J].Molecules,2011,16(9):7634-7648.

[6]Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T,et al.金冬雁,黎孟楓,等譯.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].2版.北京:科學(xué)出版社,1993:888-898.

[7]Ruhul Amin AR,Oo ML,Senga T,et al.SH2 domain containing protein tyrosine phosphatase 2 regulates concanavalin A-dependent secretion and activation of matrix metalloproteinase 2 via the extracellular signal-regulated kinase and p38 pathways[J].Cancer Res, 2003,63(19):6334-6339.

[8]Biswas MH,Hasegawa HH,Rahman MA,et al.SHP-2-Erk signaling regulates concanavalin A-dependent production of TIMP-2[J]. Biochem Biophys Res Commun,2006,348(3):1145-1149.

[9]Zhao R,Guerrah A,Tang H,et al.Cell surface glycoprotein PZR is a major mediator of concanavalin A-induced cell signaling[J].J Biol Chem,2002,277(10):7882-7888.

[10]Roy B,Pattanaik AK,Das J,et al.Role of PI3K/Akt/mTOR and MEK/ERK pathway in concanavalin A induced autophagy in HeLa cells[J].Chem Biol Interact,2014,210:96-102.

[11]Wei X,Cai J,Liu F,et al.Possibility of signal transduction through microfilaments below the membrane following ligand-receptor interaction[J].Chin Med Sci J,1993.8(4):218-222.

[12]胡良高,寧 紅,尹憶民,等.伴刀豆球蛋白A與巨噬細(xì)胞膜受體結(jié)合對(duì)膜下F-actin的影響[J].生物物理學(xué)報(bào),1996,12(1):61-66.

Concanavalin A enhances p-ERK1/2 expression in CRL2480 cells.

GONG Wen-guang,WANG Hong-mei,NIU Qing-xia.

Institute of Inflammation and Immune Disease,Department of Pathophysiology,Medical College of Shantou University,Shantou 515041,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo explore the influence of concanavalinA(ConA)on the expression of phosphorylated extracellular signal-regulated kinase(p-ERK)1/2 in CRL2480 cells(human umbilical vein endothelial cell line).MethodsActivated effect of ConAon CRL2480 endothelial cells was detected by MTT assay.P-ERK1/2 expression was examined by western blot.The distribution of p-ERK1/2 was observed via immunofluorescent staining.ResultsAfter 8h incubation,ConA increased the activated index of the cells in a dose dependent manner in the range of 5～20 μg/ml(P＜0.05).The immunoblot displayed that 20 μ g/ml ConA increased p-ERK1/2 expression in the cells(P＜0.05).PD98059 and U0126(both ERK pathway inhibitors)exerted inhibitory action on p-ERK1/2 expression(P＜0.05).The fluorescent intensities existed in the cytoplasm and the nuclei of ConA-treated cells were much stronger than those of control cells.Conclusion ConAis able to upregulate p-ERK1/2 expression in CRL2480 cells.

ConcanavalinA;Endothelial Cells;Extracellular signal-regulated kinase

R329.2+8

A

1003—6350（2014）14—2029—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.14.0790

2014-01-24)

國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào)：81072941)

牛青霞。E-mail：gongwenguang@163.com