可誘導(dǎo)心肌特異性表達(dá)TRX蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立

孫煜，李成剛，周立

(1.湖北省食品藥品監(jiān)督管理局藥品審評認(rèn)證中心，湖北 武漢 430071；2.武漢市剛子科貿(mào)有限公司，湖北 武漢 430071；3.武漢大學(xué)動物實驗中心/ABSL-3實驗室，湖北 武漢 430071)

·論著·

可誘導(dǎo)心肌特異性表達(dá)TRX蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立

孫煜1，李成剛2，周立3

(1.湖北省食品藥品監(jiān)督管理局藥品審評認(rèn)證中心，湖北 武漢 430071；2.武漢市剛子科貿(mào)有限公司，湖北 武漢 430071；3.武漢大學(xué)動物實驗中心/ABSL-3實驗室，湖北 武漢 430071)

目的建立心肌特異性、高效表達(dá)鼠源硫氧還蛋白-1(Thioredoxin 1，Trx-1)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型。方法將TRE-Tight-Trx-1與能夠控制TRE-Tight下游基因在心肌特異性表達(dá)的α-MHC-rtTA-hGH轉(zhuǎn)基因載體分別顯微注射入C57BL/6小鼠受精卵細(xì)胞中得到的分別含有一段轉(zhuǎn)基因載體的轉(zhuǎn)基因小鼠，再將這兩種轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行交配，獲得同時含有TRE-Tight-Trx-1和α-MHC-rtTA-hGH這兩段基因的雙陽性子代轉(zhuǎn)基因小鼠。使用強力霉素(Dox)持續(xù)誘導(dǎo)6周齡雙陽性小鼠6周，再用Western blot方法檢測轉(zhuǎn)基因小鼠心肌細(xì)胞中Trx-1表達(dá)量。結(jié)果與野生型C57BL/6小鼠比較，經(jīng)過強力霉素誘導(dǎo)的雙陽轉(zhuǎn)基因小鼠心肌細(xì)胞中Trx-1有高表達(dá)量(P＜0.05)。結(jié)論我們得到了可誘導(dǎo)、高效表達(dá)Trx-1的轉(zhuǎn)基因小鼠系，為心肌肥大疾病的研究和治療提供新的研究思路。

硫氧還蛋白-1；α-肌球蛋白重鏈；強力霉素；Tet-on/pTRE-Tight誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)

轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)是通過實驗技術(shù)把外源基因通過基因注射等方法導(dǎo)入動物的早期胚胎細(xì)胞或者受精卵，使外源基因與受體細(xì)胞的基因組隨機或定向的整合[1]。最為常用的是Hammer等[2]建立的原核顯微注射法，由于其插入外源基因片段的大小受限制較小，效果又很可靠，到現(xiàn)在為止依然是最主要的制備轉(zhuǎn)基因動物的方法。

Tet-on&TRE-Tight基因表達(dá)系統(tǒng)在1995年由Gossen和Bujard等建立，是一種高效、低毒以及具有高效誘導(dǎo)能力表達(dá)外源DNA的調(diào)控系統(tǒng)。該系統(tǒng)在四環(huán)素類誘導(dǎo)物的作用下，其Tet-on質(zhì)粒中反向(Tet-on)四環(huán)素調(diào)控轉(zhuǎn)錄激活因子rtTA調(diào)控元件和質(zhì)粒TRE-tight中四環(huán)素操縱元件tet07特異性結(jié)合，啟動下游目的基因的高效表達(dá)，而在無誘導(dǎo)物時則不能啟動下游基因的轉(zhuǎn)錄，具有特異性、嚴(yán)密性以及高效性的特點，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物模型。

硫氧還蛋白系統(tǒng)是生物體內(nèi)主要的抗氧化系統(tǒng)之一，由硫氧還蛋白(Thioredoxin，Trx)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAPDH)和硫氧還蛋白還原酶(Thioredoxin reductase，TrxR)三部分組成，是一個廣泛分布的NAPDH依賴性二硫化物還原酶系統(tǒng)[3-4]。Trx作為一抗氧化物，能被諸如ROS自由基氧化，也能通過清除過氧化氫，還原硫氧還蛋白過氧化物酶(Peroxiredoxin，PrX)，還原谷胱甘肽過氧化物酶-3(Glutathione peroxidise-3)等特異性酶類，進(jìn)而維持細(xì)胞正常的氧化還原水平。Trx-1細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的抗氧化酶，是一種小分子蛋白(12 kD)，由104個氨基酸殘基構(gòu)成，其蛋白結(jié)構(gòu)為3個α螺旋和4個β折疊緊密結(jié)合的球狀結(jié)構(gòu)[5]。Trx-1作為一種氧化還原調(diào)控蛋白在細(xì)胞的各種生理活動和功能中中發(fā)揮著重要的作用，其調(diào)控方式主要通過氧化還原狀態(tài)的變化實現(xiàn)。Trx-1不僅可以通過清除ROS來抵抗細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激，還可以作為一種生長因子促進(jìn)細(xì)胞的生長[5]。除此之外，Trx-1還能夠與某些含有半胱苷酸殘基的蛋白質(zhì)相互作用，從而調(diào)控這種蛋白的功能[6]。此外，Trx-1還與某些疾病的發(fā)病機制有密切關(guān)系[6]，其中之一便是抑制心肌肥大。Trx-1通過上調(diào)miR-98的轉(zhuǎn)錄促使miR-98與cyclin D2的3'UTR區(qū)域miR-98結(jié)合位點結(jié)合，抑制cycling D2的表達(dá)。因cyclin D2具有促進(jìn)心肌肥大的作用，故Trx-1能間接抑制cyclin D2的表達(dá)，進(jìn)而抑制心肌肥大的發(fā)生[7]。

基于Trx的重要生物學(xué)功能，以及缺乏合適的動物模型的現(xiàn)狀，本研究構(gòu)建了以TRE-Tight質(zhì)粒為載體，構(gòu)建可在心肌細(xì)胞誘導(dǎo)型產(chǎn)生小鼠Trx-1基因的表達(dá)質(zhì)粒系統(tǒng)，結(jié)合顯微注射技術(shù)生產(chǎn)了能夠心肌組織特異性、誘導(dǎo)性高表達(dá)鼠源Trx-1的轉(zhuǎn)基因小鼠，為心臟疾病的研究建立了Trx-1局部高表達(dá)模型，為心肌肥大疾病的研究和治療提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、感受態(tài)、細(xì)胞系和實驗動物載體Tet-on-rtTA-hGH以及TRE-Tight質(zhì)粒由本實驗室保存；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞TOP10購自天根生化科技(北京)有限公司；小鼠心肌細(xì)胞(MCM)由美國Johns Hopkins大學(xué)醫(yī)學(xué)院Dr.Yingming Tsai提供；C57/BL6小鼠由武漢大學(xué)動物實驗中心提供。

1.2 主要試劑LATaq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、dNTP、基因組DNA提取試劑盒(DV811A)購自寶生物工程(大連)有限公司；普通質(zhì)粒小提試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；高糖DMEM、胎牛血清(FBS)、100 U/ml青/鏈霉素轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamin 2000、0.25%胰酶購自Life Technologies公司、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒；質(zhì)粒大量提取試劑盒購自德國QIAGEN公司；Tris base、Tween-20、EDTA、二硫蘇糖醇(DTT)、Trition X-100、鹽酸胍(Guanidine HCl)、蛋白酶K均購于Sigma公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、TEMED、Western blot超敏發(fā)光液購于北京鼎國生物技術(shù)有限公司；兔抗鼠Trx-1一抗以及HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗購于Cell Signaling公司。

1.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

1.3.1 α-MHC promoter-rtTA-hGH質(zhì)粒的構(gòu)建以含有C57/BL6小鼠全基因為模板，用含有Xhol和HindⅢ特異性酶切位點的上下游引物擴增出含心肌特異性α-肌球蛋白重鏈(α-MHC)啟動子的片段；引物序列為：Trx-FP:5'-GCGAATTCCCCGCAACAGCCAAAA-3'，EcoRITrx-RP:5'-CGCGGATCCATGATTAGCATATTC AGTA-3'，BamHⅠ用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物Trx-1片段以及TRE-Tight質(zhì)粒，回收長度分別為337bp的IL-22片段和2.6kb的線性化TRE-Tight片段；將兩片段按照拷貝數(shù)3:1混合后用T4連接酶連接，兩者粘合成環(huán)形重組質(zhì)粒TRE-Tight-Trx-1(圖1)。

1.3.2 TRE-Tight-Trx-1質(zhì)粒的構(gòu)建以含有C57/ BL6小鼠全基因為模板，用含有EcoRⅠ和BamHⅠ特異性酶切位點的上下游引物擴增出含Trx-1的表達(dá)框片段；引物序列為：Trx-FP：5'-GCGAATTC CCCGCAACAGCCAAAA-3'，EcoRITrx-RP:5'-CGCGGATCC ATGATTAGGCATATTCAGTA-3'，BamHⅠ用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物Trx-1片段以及TRE-Tight質(zhì)粒，回收長度分別為337 bp的Trx-1片段和2.6 kb的線性化TRE-Tight片段；將兩片段按照拷貝數(shù)3:1混合后用T4連接酶連接，兩者粘合成環(huán)形重組質(zhì)粒TRE-Tight-Trx-1(圖1)。

圖1 α-MHC promoter-rtTA-hGH以及TRE-Tight-Trx-1片段構(gòu)建示意圖

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞中，用菌落PCR的方法挑選陽性單克隆子，并送到金唯智(Genewiz)生物科技有限公司進(jìn)行測序，檢查目的α-MHC啟動子片段與rtTA-hGH片段連接序列是否正確以及目的基因翻譯起始位點是否完好，獲得含有重組質(zhì)粒α-MHC promoter-rtTA-hGH(簡稱α-MHC-rt-TA-hGH)或者TRE-Tight-Trx-1的陽性克隆菌。

1.4 體外表達(dá)檢測取含有陽性克隆的細(xì)菌，大量擴增菌液，并按照質(zhì)粒提取試劑盒的操作規(guī)范提取高濃度質(zhì)粒進(jìn)行培養(yǎng)，從中提取重組質(zhì)粒，保存于-20℃，待用。將4×105個小鼠心肌細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)12 h(細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%)后進(jìn)行雙質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后6 h更換新鮮培養(yǎng)基并加入無菌過濾的強力霉素(Doxycycline)0 ng、10 ng、100 ng或1 000 ng，于誘導(dǎo)表達(dá)12 h后收集細(xì)胞，或使用100 ng Doxycycline誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)6 h、12 h以及24 h后收集細(xì)胞，使用TRI Reagent提取細(xì)胞總RNA，并使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。使用鼠源Trx-1特異性引物通過熒光定量PCR的方法對cDNA中Trx-1的表達(dá)進(jìn)行檢測，以未經(jīng)過處理的細(xì)胞的Trx-1表達(dá)量定義為1，計算經(jīng)過處理后的細(xì)胞內(nèi)Trx-1表達(dá)量的增加倍數(shù)。檢測的引物序列分別為Trx-1D15'-CAAGCCCCCAT和Trx-1D25'-GCAACAT ATCCTG'(產(chǎn)物長度為84 bp)，結(jié)果用軟件Graph pad Prism5.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.5 顯微注射用線性DNA的制備取含有陽性克隆的細(xì)菌，大量擴增菌液，并按照QIAGEN質(zhì)粒大量提取試劑盒的操作規(guī)范提取高濃度質(zhì)粒進(jìn)行培養(yǎng)，從中提取重組質(zhì)粒，并分別用限制性核酸內(nèi)切酶XhoⅠ與NotⅠ(α-MHC-rtTA-hGH)或者XhoⅠ(TRE-Tight-Trx-1)進(jìn)行酶切，使用QIAGEN膠回收試劑盒將酶切片段回收，純化后的DNA調(diào)整濃度為1 μg/μl，-20℃保存，待用于基因注射。

1.6 轉(zhuǎn)基因小鼠的制備與檢測獲得新生小鼠后，將鼠尾用200 μl DNA裂解液(0.5%SDS、0.05 mol/L EDTA、0.1 mol/L NaCl、0.01 mol/LTris。HCl使用前加入終濃度為1 mg/ml的蛋白酶K)裂解后作為模板DNA，用檢測引物檢測其基因型(引物分別為rtTA檢測引物rtTAD1：5'-TGGGAGTTTGTTTTGGCAC-3'和rt-TA D2：5'-ATGGCTAAGGCGTCGAG-3'，產(chǎn)物長度為380 bp)以及Trx-1的檢測引物Trx-1 D1和Trx-1 D2。反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性10 min，然后94℃30 s，60℃30s，72℃60s，共30個循環(huán)，最后72℃延伸5 min)。最終得到3個α-MHC-rtTA-hGH Founders，編號分別為10，19，30；兩個得到TRE-Tight-Trx-1Foundes，編號分別為9，13。將含有其中一種轉(zhuǎn)基因片段的小鼠分別作為父母系進(jìn)行繁殖，對獲得的子代小鼠使用上述方法進(jìn)行基因鑒定。參照Zheng等[8]的方法將篩選出的同時含有兩種轉(zhuǎn)基因片段的小鼠(雙陽性小鼠)分窩后單獨飼養(yǎng)，連續(xù)喂飲含有強力霉素的飲用水6周，刺激Trx-1在心肌大量表達(dá)。

1.7 小鼠心肌細(xì)胞的分離將小鼠按照Zhang等[9]的方法處理，收集心臟血液并對心臟進(jìn)行清洗。取出心臟剪碎后，用PBS漂洗3次，去除殘余的血細(xì)胞和死細(xì)胞，再加入0.25%胰酶，于37℃消化10 min，搖蕩20 s，再放入37℃消化。10 min后靜置后吸取上清用胎牛血清終止消化，將收集的消化液上清用200目篩網(wǎng)過濾，收集分離的心肌細(xì)胞，離心5 min，用PBS漂洗2次，使用含有10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基重選后放置于T25培養(yǎng)皿中于37℃培養(yǎng)1 h。因心肌細(xì)胞不貼壁，吸取懸浮細(xì)胞即含有高濃度的心肌細(xì)胞，重懸培養(yǎng)。

1.8 轉(zhuǎn)基因小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)Trx-1的表達(dá)向心肌細(xì)胞中加入無菌過濾的強力霉素(Doxycycline)1 000 ng，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)Trx-1表達(dá)72 h后，用G-lysis緩沖液(pH值為8.3的50 mmol/L Tris鹽酸緩沖液，3 mmol/L EDTA，6 mmol/L鹽酸胍，0.5% TritonX-100)收集細(xì)胞蛋白質(zhì)，37℃避光放置30 min，加入蛋白上樣緩沖液電泳至溴酚藍(lán)帶泳出膠外8 min，轉(zhuǎn)至PVDF膜(40V，3 h)，5%封閉液室溫封閉1 h，加入一抗(羊抗鼠Trx1 1:15 000)，4℃避光過夜，再加入二抗(1:3 000)室溫1 h，最后用超敏發(fā)光液化學(xué)發(fā)光，顯影，定影。

2 實驗結(jié)果

2.1 質(zhì)粒體外表達(dá)Trx-1的檢測誘導(dǎo)性產(chǎn)生Trx-1的檢測結(jié)果見圖2。在α-MHC-rtTA-hGH以及TRE-Tight-Trx-1系統(tǒng)中，Trx-1在mRNA水平的表達(dá)量隨著時間的延長而增多(圖2A)，表明強力霉素能夠一直誘導(dǎo)Trx-1表達(dá)。而用于誘導(dǎo)表達(dá)的強力霉素的量與最終Trx-1的表達(dá)量成比例(圖2B)。

圖2 Trx-1的誘導(dǎo)表達(dá)檢測

2.2 體內(nèi)檢測Trx-1蛋白的表達(dá)由Western Blot顯色以及條帶分析結(jié)果可見，與野生型小鼠(WT)以及未經(jīng)強力霉素誘導(dǎo)的小鼠(Tg-0周)相比，經(jīng)過強力霉素誘導(dǎo)6周后的雙陽性轉(zhuǎn)基因小鼠心肌細(xì)胞中Trx-1蛋白表達(dá)量明顯增高(見圖3)，說明在強力霉素誘導(dǎo)下，我們構(gòu)建的雙陽性轉(zhuǎn)基因小鼠能夠高水平的表達(dá)Trx-1蛋白。

圖3 心肌細(xì)胞中Trx-1蛋白的表達(dá)水平

3 討論

肌球蛋白是心肌肌小節(jié)粗肌絲的主要成分，由重鏈(MHC)和輕鏈(MLC)組成。在心肌中MHC有兩種亞型，即α-MHC和β-MHC。α-MHC是成年機體心肌中的主要形式[10]。Gulick等[11]分離出小鼠心肌MHC基因座，并鑒定了α-MHC基因的啟動子區(qū)，α-MHC啟動子能夠在心肌中特異性驅(qū)動CAT基因的表達(dá)，而非心肌組織中不表達(dá)。本研究克隆了α-MHC基因的啟動子區(qū)，α-MHC啟動子全長約5 kb，將α-MHC啟動子連接到rtTA-hGH的5'端，控制下游基因rtTA在心肌細(xì)胞中特異性的高表達(dá)。我們利用人心肌細(xì)胞在體外進(jìn)行的檢測實驗結(jié)果也證明我們構(gòu)建的α-MHC promoter-rtTA-hGH能夠指導(dǎo)rt-TA蛋白在心肌細(xì)胞中特異性表達(dá)。

Trx-1在細(xì)胞內(nèi)具有非常重要的調(diào)控作用，據(jù)報道，這種蛋白質(zhì)和心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)[12-14]。在針對心肌肥大的疾病研究中，Trx-1更是被視為治療或者預(yù)防的新型藥物，但是其功能和作用機理并未在體內(nèi)實驗中得到證實。此外，由于Trx-1在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著非常重要的作用，在同一組織類型中也發(fā)揮不同作用，我們不僅需要建立表達(dá)Trx-1的動物模型，還需要能夠隨時調(diào)控其特異性表達(dá)的調(diào)控手段進(jìn)行輔助。

目前基因動物的構(gòu)建主要用的是單質(zhì)粒的顯微注射，由于轉(zhuǎn)基因動物的周期很長，如果目的基因具有一定的生物毒性或?qū)C體存在潛在危害，就會造成工具鼠數(shù)量不足，獲得率低。誘導(dǎo)性表達(dá)質(zhì)粒體系的應(yīng)用能很好的解決這個問題，我們能夠通過在小鼠繁殖期間關(guān)閉基因的表達(dá)來避免表達(dá)的基因產(chǎn)物的生物毒性毒殺新生小鼠，而在小鼠成年后再開啟轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)構(gòu)建我們需要的動物模型。根據(jù)我們的實驗，在Tet-on質(zhì)粒系統(tǒng)的調(diào)控下，目的基因的蛋白表達(dá)量跟時間呈正相關(guān)，我們能夠依據(jù)這種特性逐步建立轉(zhuǎn)基因的模型。誠然雙質(zhì)粒在體外試驗中會提高轉(zhuǎn)染的難度，但是我們在體內(nèi)實驗中可以通過將兩個質(zhì)粒分別基因注射到兩只小鼠，構(gòu)建兩種不同的轉(zhuǎn)基因小鼠系，應(yīng)用時再將兩種小鼠交配獲得雙陽性小鼠用于實驗。

我們建立的雙質(zhì)粒轉(zhuǎn)基因模型不但可以解決Trx-1潛在的生物毒性問題，還能夠通過將含有Trx-1的轉(zhuǎn)基因小鼠與含有不同的控制特異性表達(dá)的啟動子的轉(zhuǎn)基因小鼠交配，獲得一系列在不同組織和細(xì)胞中特異性表達(dá)Trx-1的小鼠。建立這樣一個平臺，對于豐富小鼠品系打下了堅實的基礎(chǔ)。如果擁有大量控制特異性表達(dá)的啟動子的轉(zhuǎn)基因小鼠，往后建立任何一種含有目的基因的小鼠都能通過交配的方式獲得一系列特異性表達(dá)該基因的小鼠系，使后期工作變得簡便，省時。

（志謝：目的DNA顯微注射這部分工作由武漢大學(xué)動物實驗中心吳珂老師完成，特此感謝。）

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Establishment of transgenic mice model with myocardium-specific expression of TRX protein.

SUN Yu1,

LI Cheng-gang2,ZHOU Li3.
1.Drug Certification Center of Food and Drug Administration,Wuhan 430071,Hubei, CHINA;2.Gangzi Technology&Trade Co,LTD,Wuhan 430071,Hubei,CHINA;3.Wuhan University Laboratory Animal Center/ABSL-3 Labaratory,Wuhan 430071,Hubei,CHINA.

ObjectiveTo establish Thioredoxin 1(Trx-1)transgenic mice model with myocardium-specific high expression of Thioredoxin(Trx-1).MethodsTRE-Tight-Trx-1 and α-MHC-rtTA-hGH gene vector which specifically controls the expression of TRE-Tight downstream gene in cardiomyocytes were microinjected into the zygote of C57BL/6 mice respectively for establishing the transgenic mice with transgenic vectors.After mating,a double-positive offspring with bothTRE-Tight-Trx-1 and α-MHC-rtTA-hGH gene were obtained.And then doxycycline was added to feed the double positive transgenic mice aged over 6 weeks for 6 weeks,where the concentration of Trx-1 in cardiomyocytes was detected by Western Blot.ResultsThe transgenic mice feeding with doxycycline showed high expression levels of Trx-1 in cardiomyocytes compared with wild type C57BL/6 mice.ConclusionWe established a Trx-1 transgenic mice model with inducible and high expression of Trx-1,which provided a new pattern of thinking in the research and therapy for cardiac hypertrophy.

Thioredoxin 1;α-myosin heavy chain(α-MHC);Doxycycline;Tet-on/pTRE-tight system

R-332

A

1003—6350（2014）08—1093—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.08.0427

2013-11-07)

周立。E-mail：zhouli_jerry@whu.edu.cn