毒素蛋白CcdB在載體構(gòu)建中的研究及應(yīng)用

范凱榮，覃石磊，黃進波，晁耐霞

廣西醫(yī)科大學 基礎(chǔ)醫(yī)學院，廣西 南寧 530021

Ccd（control of cell division or death system）系統(tǒng)位于大腸桿菌F質(zhì)粒上，與細菌分裂后生存和SOS修復誘導有關(guān)，也是最早被發(fā)現(xiàn)、目前研究最為深入的一種毒素-抗毒素系統(tǒng)（toxin-antitoxin sys?tem，TA系統(tǒng)）[1]。ccd系統(tǒng)編碼2個蛋白，分別是毒素蛋白CcdB和抗毒素蛋白CcdA。毒素蛋白CcdB通過使細菌促旋酶失活而導致細菌死亡，CcdA可通過直接結(jié)合CcdB蛋白形成復合體解除其毒性。由于細胞內(nèi)CcdA蛋白相對于CcdB蛋白比較易降解，從而導致丟失F質(zhì)粒的子代細菌的死亡[2]。這一原理被廣泛應(yīng)用于各種高效低背景質(zhì)粒的載體構(gòu)建中，廣泛應(yīng)用于基因克隆和基因功能的研究。

1 ccd系統(tǒng)及其致死效應(yīng)作用原理

1.1 ccd系統(tǒng)的組成及結(jié)構(gòu)

ccd 系統(tǒng)定位于大腸桿菌 F 質(zhì)粒的 42.9～43.6 kb，毒素蛋白基因ccdB與抗毒素蛋白基因ccdA位于同一個操縱子內(nèi)，前后相鄰排列[3]。毒素蛋白CcdB（相對分子質(zhì)量為11.7×103）比較穩(wěn)定，有5個反向平行β折疊緊接著C端的α螺旋，其中的一個β折疊上有3個小的翼型折疊，上面含有LysC蛋白水解切割位點和CcdA識別位點[4]?？苟舅氐鞍證cdA（相對分子質(zhì)量為8.7×103）比較不穩(wěn)定，在細胞內(nèi)易被Lon蛋白酶水解；其N端結(jié)構(gòu)域是DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，能夠特異性識別位于ccd操縱子上6 bp的DNA啟動子區(qū)域（回文結(jié)構(gòu)），通過帶正電荷的折疊插入DNA的大溝起到調(diào)節(jié)作用，其C端與CcdB蛋白結(jié)合[5]。

1.2 ccd系統(tǒng)致死效應(yīng)作用原理

研究認為，CcdB蛋白主要通過捕捉斷裂的DNA-促旋酶復合體并使細胞內(nèi)拓撲異構(gòu)酶失活，從而干擾DNA的合成，進而殺傷宿主細胞。促旋酶是原核生物細胞中高度保守的酶，屬于拓撲異構(gòu)酶Ⅱ，導入負超螺旋進入同一閉合雙鏈DNA中。由于在高等生物中缺乏促旋酶類似物，因此促旋酶是抗生素類藥物研究的重要靶標。大腸桿菌的促旋酶為四聚體，由2個GyrA亞基和2個GyrB亞基組成。促旋酶能夠識別DNA超螺旋[6]，促旋酶GyrA二聚體的N端相對分子質(zhì)量為60×103的結(jié)構(gòu)域可以切斷DNA雙鏈，形成DNA門（DNA gate）。GyrA亞基C端與臨近DNA門的一段DNA（T segment，又稱DNA T片段）纏繞變構(gòu)后與GyrB亞基N端結(jié)構(gòu)域結(jié)合。GyrB的N端結(jié)構(gòu)形狀類似于鉗子，與1分子ATP結(jié)合變構(gòu)形成閉合狀態(tài)，易于捕獲DNA T片段。GyrB水解ATP后發(fā)生旋轉(zhuǎn)，牽引DNA T片段從DNA門處移出，DNA門重新連接，DNA分子導入2個負超螺旋，最后GyrB再結(jié)合1分子ATP并水解，促旋酶2個亞基解離分開。CcdB蛋白能夠捕捉斷裂的DNA-促旋酶復合體并與之結(jié)合形成穩(wěn)定的復合體，阻止促旋酶發(fā)揮活性，這一復合體導致DNA復制的終止。同時也有研究證實，這一復合體也能阻滯RNA聚合酶的前進，最終導致轉(zhuǎn)錄終止。分析CcdB-GyrA的晶體結(jié)構(gòu)得知，當DNA呈線性結(jié)構(gòu)時，促旋酶上的信息才會誘導CcdB發(fā)揮致死作用[7-9]。

CcdB的致死作用可被抗毒素蛋白CcdA抑制。CcdA分子的C端可與CcdB上2個部分重疊的位點實行連續(xù)的非共價結(jié)合，并引發(fā)CcdB構(gòu)象改變，使得CcdB-促旋酶復合體因為局部構(gòu)象的改變而出現(xiàn)分離[10]。CcdA的C端41個氨基酸殘基是結(jié)合CcdB的必需殘基。不同的自然壞境下CcdA和CcdB的結(jié)合模式會發(fā)生改變，其結(jié)合模式依賴于兩者間的濃度比，即CcdA與CcdB之間的比率大于等于1時，二聚物（CcdA）2和（CcdB）2相互交替組成鏈狀四聚體（CcdA）2（CcdB）2時，CcdA對CcdB有抑制作用；相反，當CcdA與CcdB之間的比率小于1時，就會形成六聚體（CcdA）2（CcdB）4，此時CcdA對CcdB無抑制作用[11]。此外，（CcdA）2（CcdB）2復合體還能抑制ccd操縱子的轉(zhuǎn)錄，這一功能主要通過復合體中CcdA蛋白與ccd操縱子啟動子區(qū)域的結(jié)合來實現(xiàn)，CcdB的結(jié)合促進CcdA與DNA的親和性增高，結(jié)合區(qū)域位于ccdB開放讀框起始位點上游113 bp處。因此，不同的CcdA和CcdB間的濃度比，也決定ccd操縱子的開與關(guān)，從而使兩者的含量處于動態(tài)平衡中，以精確地調(diào)控細菌的生長[12]。

2 CcdB在質(zhì)粒載體構(gòu)建中的應(yīng)用

2.1 ccdB基因在載體構(gòu)建中的應(yīng)用原理

基因克隆和表達是基因組學和蛋白組學研究的基礎(chǔ)，目前基因克隆過程中重組體篩選系統(tǒng)通常采用遺傳檢測方法，即抗藥性標記插入失活、β-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)和插入序列表性特征等，能夠鑒別陽性克隆和陰性克隆，但也伴有多種因素造成的不可避免的假陽性克隆問題，以及繁瑣的驗證工作量。將ccdB同源基因同框融合進入重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒編碼的CcdB蛋白對宿主細胞具有致死效應(yīng)；而在該同源基因內(nèi)插入外源基因片段，則導致ccdB讀框移碼突變，編碼的CcdB蛋白喪失了對宿主的毒性，從而使重組表達質(zhì)粒在宿主細胞內(nèi)生存繁殖生存，最終達到陽性篩選的作用，同時也能有效降低背景陰性克隆和假陽性克隆，極大地減少了驗證工作量。自Bernard和Couturier等發(fā)現(xiàn)促旋酶突變的大腸桿菌促旋梅突變體（GyrA Arg462→Cys）對CcdB蛋白的毒性耐受[13]，使得CcdB蛋白被廣泛應(yīng)用于高效低背景的質(zhì)粒載體構(gòu)建。此外，CcdB毒性往往與抗藥性標記插入失活或β-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)一起應(yīng)用于基因克隆重組子的篩選，大大提高了篩選陽性克隆的效率。

2.2 ccdB基因在載體構(gòu)建中的應(yīng)用

目前ccdB基因同源片段已用于多種高效低背景質(zhì)粒載體的構(gòu)建，如TA克隆載體、平末端克隆載體、表達載體等，這些載體廣泛應(yīng)用于細菌、真菌、植物和動物基因的功能研究，詳見表1。

最先將ccdB基因引入載體構(gòu)建的是比利時的Philippe等，他們將ccdB基因與pUC18/19質(zhì)粒的lac啟動子后的多克隆位點區(qū)域同框融合，構(gòu)建衍生的質(zhì)粒pKIL18/19，將該衍生質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進入促旋酶野生型的大腸桿菌后能抑制細菌的生長；而當ccdB基因被外源片段插入后，則沒有抑制細菌生長的功能，在豐富培養(yǎng)基上才可以形成可見的克隆[14]。

表1 利用ccdB基因構(gòu)建的載體舉例

TA克隆法因操作簡單、快速高效，而被廣泛應(yīng)用于基因工程，多數(shù)實驗室對目的基因的克隆常選用TA克隆法，利用ccdB構(gòu)建的載體克隆率較高。陳其軍等設(shè)計的引物在ccdB片段兩端分別引入一個AhdⅠ酶切位點，并對模板進行PCR擴增，利用定點突變方法沉默pBlueScriptSK（-）載體中Amp抗性基因的AhdⅠ酶切位點，獲得骨架pSKAΔhd，將PCR產(chǎn)物與pSKAΔhd分別用SalⅠ、XbaⅠ雙酶切，經(jīng)連接反應(yīng)，獲得前T載體pSK01（pSK02和pSK03構(gòu)建方法相同），經(jīng)AhdⅠ酶切即得T載體。他們通過克隆 NCED3（1.8 kb）和 DREB1A（0.68 kb）進行驗證，克隆率均為100%（除pSK03與DREB1A克隆率為96%外）。另外，ccdB在該載體構(gòu)建中除致死效應(yīng)外，還起到間隔作用，解決了非重組轉(zhuǎn)化子的本底過高的問題。但TA克隆法仍存在加尾效率和連接效率低等問題[15-16]。

近年來，Hu等用ccdB片段構(gòu)建出平末端載體，既避免了TA克隆法中加尾效率等問題，又可降低假陽性克隆率。該課題組首先對3對寡聚核苷酸鏈進行PCR擴增，在5'端和3'端分別引入Eco31Ⅰ位點，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)Eco31Ⅰ酶切、連接成環(huán)狀ccdB基因，再與骨架pUC18分別用EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切，連接獲得前載體pUC-ccdB，經(jīng)EcoRⅤ或SmaⅠ酶切即得平末端載體。實驗者用不同大小的PCR產(chǎn)物進行驗證，93 bp插入片段可使ccdB基因失活；3000 bp片段的轉(zhuǎn)化效率為每毫克DNA轉(zhuǎn)化數(shù)3×105～5×105，且無假陽性克隆轉(zhuǎn)化子[17]。

ccdB基因片段還可插入載體構(gòu)建表達載體。pGR-PSLIC、pJL-PSLIC、pMBP1-PSLIC是基于LIC的植物表達載體，在其構(gòu)建過程中將SnaBⅠ位點分別引入骨架載體和ccdB片段，ccdB插入骨架載體2個LIC連接位點之間，所得前載體經(jīng)SnaBⅠ酶切即可獲得表達載體。該系列載體可為植物基因組學研究提供高效、高產(chǎn)量的表達分析工具[18]。

2.3 利用ccdB構(gòu)建載體技術(shù)的商業(yè)化

Invitrogen公司已推出多種克隆技術(shù)，并利用ccdB進行了改進。Gateway技術(shù)即利用了ccdB選擇方法，確保高效率的分離重組克隆，典型的效率高于95%。Gateway Vector Conversion System with One Shot ccdb Survival Competent Cells，就是通過在中間載體2個重組位點間添加ccdB篩選標記來實現(xiàn)的。Zero Background技術(shù)采用ccdB基因，能夠進行高效克隆，產(chǎn)生近100%的重組體。Topo平端克隆技術(shù)主要改良載體設(shè)計，把ccdB基因插入多克隆位點，改善了傳統(tǒng)TA克隆高背景的缺點，并節(jié)省篩選時間。Zero Blunt TOPO PCR克隆試劑盒結(jié)合了Zero Background技術(shù)和pCR-Blunt II-TOPO載體中的TOPO克隆，能簡單、高效地對使用高保真PCR酶生成的平端PCR產(chǎn)物進行DNA克隆。

3 結(jié)語

目前，以ccdB基因作為陽性選擇的標記物應(yīng)用到高效零背景載體的構(gòu)建已成為基因工程研究的重要方法。但ccdA、ccdB基因家族僅在5種革蘭陰性菌中有發(fā)現(xiàn)，且表達功能不甚相同，因此，研究ccdA、ccdB基因家族的功能和分布特點，以及誘導對大部分細菌有抑制作用的CcdB蛋白表達，將為CcdB的廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。此外，如何將ccdB與其他篩選標記聯(lián)合應(yīng)用從而達到更高效的篩選效果，是未來利用ccdB構(gòu)建載體的另一個發(fā)展方向。

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