調(diào)節(jié)性T細胞在健康人群中的表達

周文超，李薇，熊小敏

1.廣州軍區(qū) 廣州總醫(yī)院檢驗科，廣州軍區(qū) 檢驗中心，廣東 廣州 510010；2.廣州中醫(yī)藥大學，廣東 廣州 510405

Sakaguchi等于1995年首次提出CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞（Treg細胞）是一種具有免疫抑制/調(diào)節(jié)作用的細胞群；2003年，Treg細胞被正式確認為獨立的T細胞亞群。Treg細胞與感染、腫瘤、移植、自身免疫性疾病等多種疾病密切相關[1-2]。

CD4+CD25+Treg細胞特異性表達Foxp3（fork?head/winged helix transcription factor 3，叉頭狀/翼狀螺旋轉錄因子3），F(xiàn)oxp3與Treg細胞的發(fā)育和功能密切相關，同時也是維持其免疫抑制功能的必要條件[3]。目前公認Foxp3是CD4+CD25+Treg細胞特有的細胞標志。CD4+CD25+Treg細胞高表達Foxp3，而只有很少的其他細胞表達Foxp3[4]。由于Foxp3位于細胞內(nèi)，檢測時需要打孔破膜，影響細胞活性，目前的技術尚不能直接分離活的Foxp3陽性細胞。2006年Liu等[5]發(fā)現(xiàn)，CD127（IL-7受體）與Foxp3的表達有相關性。Seddiki等[6]發(fā)現(xiàn)，CD4+T細胞活化后高表達CD127，而Treg細胞則低表達CD127（CD4+CD25highCD127dim），因此CD127可以幫助識別Treg細胞與活化的T細胞。王會平等[7]報道，CD4+CD25+CD127low三標記法是檢測Treg細胞的最理想指標。目前少見有關CD4+CD25+CD127lowTreg細胞的正常人參考范圍的報道，迄今有關CD4+CD25+CD127lowTreg細胞的報道大部分是對照組與不同疾病組進行比較，且所有有關對照組CD4+CD25+CD127lowTreg細胞的表達范圍均不相同。為此，我們采用流式細胞術，對2011年12月～2012年8月來我院健康體檢的人群外周血單個核細胞中CD4+CD25+CD127lowTreg細胞的表達水平進行了調(diào)查分析，以此建立本實驗室健康成年人外周血中的參考范圍，方便我院臨床醫(yī)生對移植、腫瘤等相關疾病的研究，期望能夠為臨床治療、判斷病程預后提供有價值的數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 觀察對象

收集2011年12月～2012年8月廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院體檢中心健康成年人外周血標本180例，這些觀察對象在本院體檢期間血常規(guī)、尿常規(guī)、生化、肝功能、腎功能、腫瘤標志物等各項指標均在正常范圍內(nèi)；心電圖、胸部X線檢查、腹部B超影像分析均未見明顯異常；無明顯的心、腦血管疾患，故視為健康人群。其中男99例、女81例，年齡17～84歲，平均43.64歲。根據(jù)性別分為男女2組；根據(jù)不同年齡段分為17～29歲（n=51）、30～39歲（n=34）、40～49歲（n=24）、50～59歲（n=36）、≥60歲（n=35）共5個組，依次編為1、2、3、4、5組。

1.2 其他材料

CD4-FITC、CD25-PE、鼠抗人 CD127-PerCPCy5.5、鼠IgG1-PE、鼠IgG1-PerCP-Cy5.5、溶血劑、鞘液、流式細胞儀BD FACS Calibur、細胞分析管（BD Biosciences公司）；TL-5.0w臺式離心機（上海市離心機械研究所有限公司）。

1.3 方法

清晨空腹采取EDTA-K3抗凝靜脈血2 mL，每份標本設測定、同型對照2管，于測定管中加入CD4-FITC、CD25-PE 各 10 μL、鼠抗人 CD127-PerCPCy5.5 2 μL；同 型 對 照 管 中 加 入 CD4-FITC、鼠IgG1-PE 各 10 μL，鼠 IgG1-PerCP-Cy5.5 2 μL；分別于2管中各加入100 μL抗凝血劑后振蕩混勻，室溫避光標記15 min；加入1 mL溶血劑，振蕩混勻，室溫避光溶血10 min；2000 r/min離心2 min，棄上清液，加鞘液1 mL，2000 r/min離心2 min，棄上清液，加鞘液500 μL，充分混勻后上機分析。用Cell?quest軟件，以同型對照管CD4/SSC散點圖中CD4+FITC細胞群設門，確定鼠IgG1-PE/鼠IgG1-PerCPCy5.5散點圖中的陰性區(qū)域，分析測定管Cellquest圖中右下象限CD25+CD127low細胞群陽性百分率。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以x±s表示，組間比較采用t檢驗或單因素方差分析。

2 結果

2.1 不同性別健康成年人外周血中CD4+CD25+CD127lowTreg細胞的百分率

用Levene檢驗方差齊性，結果顯示方差齊（F=0.321，P=0.572），采用獨立樣本的 t檢驗，不同性別健康成年人外周血中CD4+CD25+CD127lowTreg細胞百分率男、女分別為（4.06±1.56）%和（3.59±1.48）%，無顯著性差異（P＞0.05）。

2.2 不同年齡段各組間外周血中CD4+CD25+CD127lowTreg細胞的百分率

應用單向方差分析，各組間進行兩兩比較，結果顯示1、2、3組間無顯著性差異（P＞0.05），4、5組間無顯著性差異（P＞0.05）；1、2、3組分別與4、5組間具有顯著性差異（P＜0.05）。參見表1。

2.3 健康成年人外周血中CD4+CD25+CD127lowTreg細胞百分率參考范圍的確定

統(tǒng)計結果顯示，不同性別健康成年人CD4+CD25+CD127lowTreg細胞的百分率無顯著性差異；17～49歲不同年齡段3組間無顯著差異，≥50歲2組間亦無顯著差異，而這2個年齡段之間則存在顯著性差異。根據(jù)統(tǒng)計分析結果，CD4+CD25+CD127lowTreg細胞參考范圍在實際使用中可忽略性別，但須依據(jù)17～49歲、≥50歲2個年齡段設不同的截斷值，具體范圍確定為≤49歲為（3.30±1.45）%，≥50歲為（4.69±1.27）%。參見表2、圖1。

3 討論

CD4+CD25+CD127lowTreg細胞與腫瘤、移植疾病、自身免疫性疾病等密切相關，在不同的疾病中有升高或降低的趨勢。以往有關Treg細胞的研究中，多以CD4+CD25+細胞群中的Foxp3為主。Foxp3被認為是特異性表達于CD4+CD25+Treg細胞的關鍵標記分子，在一定程度上可反映CD4+CD25+Treg細胞的水平和功能活性，可作為證實CD4+CD25+Treg細胞的表面標志[8-9]。但由于Foxp3是在細胞內(nèi)表達，檢測分析時須破膜打孔，檢測過程長、復雜，且易影響細胞活性及丟失細胞數(shù)目，從而影響檢測結果的準確性[10]。2006年Liu等發(fā)現(xiàn)CD127（IL-7受體）與Foxp3的表達呈負相關。與此同時，Seddiki等發(fā)現(xiàn)CD127可以幫助識別CD4+CD25+Treg細胞與活化的T細胞，CD4+T細胞活化后高表達CD127（CD4+CD25+CD127high），而真正的Treg細胞僅表達較低的CD127（CD4+CD25+CD127low）。因此，在 CD4+CD25+基礎上聯(lián)合CD127抗原，可以更好地識別人CD4+CD25+Treg細胞[7]。迄今在有關CD4+CD25+CD127lowTreg細胞的研究中，少見該指標參考范圍的報道，多建立在疾病觀察組與對照組比較上[11-13]。國內(nèi)郭新紅等[11]報道健康對照組為（4.02±1.66）%，嚴波等[12]報道健康對照組為（6.027±0.854）%，結荊線等[13]報道健康對照組為（3.21±0.96）%，王盈等[14]報道健康人為（6.55±0.11）%，Zhang 等[15]報道健康對照組為（5.44±1.44）%，Guo 等[16]報道 健 康對照組（2.5±0.9）%。綜上，有關CD4+CD25+CD127lowTreg細胞指標的報道不盡一致。本研究結果顯示，CD4+CD25+CD127lowTreg細胞指標男性略高于女性，但經(jīng)過統(tǒng)計學分析，性別之間無顯著差異，表明該指標在應用于臨床時可以忽略性別。本研究還顯示，17～49歲間3個年齡段無顯著性差異，≥50歲的2個年齡段無顯著差異，而17～49歲與≥50歲2個年齡段間則存在顯著差異，表明臨床應用該指標時應根據(jù)17～49歲及≥50歲設2個不同的截斷值為參考范圍。

表1 不同年齡段健康成年人外周血中CD4+CD25+CD127lowTreg細胞的百分率（x±s）

表2 健康成年人外周血中CD4+CD25+CD127low Treg細胞的百分率（x±s）

本實驗數(shù)據(jù)與有關報道存在差異[11～16]，可能與地域、試劑、標本的選擇有關。本研究建立的CD4+CD25+CD127lowTreg細胞健康成年人表達范圍具前瞻性與創(chuàng)新意義，可用于腫瘤、器官移植、慢性特發(fā)性血小板減少性紫癜等多種疾病的臨床治療與療效觀察，并對疾病的病程轉歸具有一定的探討價值。由于年齡大于50歲的人群或多或少存在某些慢性疾患，真正意義上的健康人標本來源較少，存在一定的局限性，有待于后續(xù)研究中加以補充完善。

圖1 流式細胞術檢測≤49歲與≥50歲健康成年人外周血中CD4+CD25+CD127lowTreg細胞的表達范圍

[1] 鄧茜,肖影群.CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞及其在肝病的研究進展[J].重慶醫(yī)學,2012,41(10):1004-1006.

[2] 何凡,陳知水,陳孝平,等.術前調(diào)節(jié)性T細胞水平與肝癌肝移植術后腫瘤復發(fā)的關系[J].外科理論與實踐,2008,13(4):341-343.

[3] Shevach E M.Mechanisms of foxp3+T regulatory cell-mediat?ed suppression[J].Immunity,2009,30:636-645.

[4] Pacholczyk R,Kraj P,Ignatowicz L.Peptide specificity of thy?mic selection of CD4+CD25+T cells[J].Immunology,2002,168(2):613-620.

[5] Liu W,Putnam A L,Zhou X Y,et al.CD127 expression in?versely correlates with FoxP3 and suppressive function of hu?man CD4+T reg cells[J].J Exp Med,2006,203(7):1701-1711.

[6] Seddiki N,Santner-Nanan B,Martinson J,et al.Expression of interleukin(IL)-2 and IL-7 receptors discriminates between human regulatory and activated T cell[J].J Exp Med,2006,203:1693-1700.

[7] 王會平,翟志敏,張愛梅,等.CD4+CD25+CD127low識別人外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞的優(yōu)勢[J].中國免疫學雜志,2008,24(12):1059-1062.

[8] Yagi H,Nomura T,Nakamura K,et al.Crucial role of Foxp3 in the development and function of human CD4+CD25+regula?tory T cells[J].Int Immunol,2004,16(11):1643-1656.

[9] Hori S,Nomura T,Sakaguchi S.Control of regulatory T cell developmentby the transcription factorFoxP3[J].Science,2003,299(5609):1057-1061.

[10]Morgan M E,van Bilsen J H,Bakker A M,et al.Expression of FOXP3 mRNA is not confined to CD4+CD25+T regulatory cells in humans[J].Hum Immunol,2005,66(1):13-20.

[11]郭新紅,范佳鑫,阿依姆妮薩,等.CD4+CD25+CD127low調(diào)節(jié)性T細胞及相關細胞因子與慢性特發(fā)性血小板減少性紫癜的研究[J].中國免疫學雜志,2011,27(1):73-75.

[12]嚴波,燕善軍.惡性腫瘤患者腹水及外周血中CD4+CD25+CD127low調(diào)節(jié)性T細胞表達及其意義[J].實用醫(yī)學雜志,2010,26(9):1570-1571.

[13]結荊線,喬麗娟,郭愛芝,等.卵巢癌患者外周血CD4+CD25hiCD127lo調(diào)節(jié)性T細胞格局變化及臨床意義[J].中國免疫學雜志,2012,28(1):49-53.

[14]王盈,周磊明,宮菊麗,等.中國健康人外周血中具有CD4+CD25nt/hCD127low特征的調(diào)節(jié)性T細胞頻率[J].細胞與分子免疫學雜志,2007,23(9):816-819.

[15]Zhang Shenghui,Han Yixiang,Wu Jianbo,et al.Elevated fre?quenciesCD4+CD25+CD127lowregulatory T cells is associated to poor prognosis in patients with acute myeloid leukemi[J].Int J Cancer,2011,129(6):1373-1381.

[16]Guo Y,Wu C Z,Liao Y,et al.The Expression and signifi?cance of CD4+CD25+CD127low/-regulatory T cells and Foxp3 in patients with portal hypertension and hypersplenis[J].Hepato?gastroenterology,2013,60(123):581-584.