產(chǎn)L-蘋果酸重組大腸桿菌的構(gòu)建

吳亞斌，張 梁，石貴陽

(江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗室，無錫 214122)

L-蘋果酸是生物體內(nèi)三羧酸循環(huán)的重要一員，在生物體中具有重要的生理功能［1］;同時也是天然果酸的重要組成部分，其酸味持久柔和，是優(yōu)良的酸味劑。因為上述特性，L-蘋果酸在醫(yī)藥、食品等多個行業(yè)中都有廣泛用途［2］。合成單一手性的L-蘋果酸主要方法有細(xì)胞/酶轉(zhuǎn)化法和微生物發(fā)酵法［3］，胡永紅等［4］以富馬酸鈣為底物，采用游離延胡索酸酶，直接轉(zhuǎn)化生成蘋果酸鈣，在40℃、pH 7.0～7.5的條件下，每升延胡索酸酶液能在20～28 h可將3.2 kg的富馬酸鈣轉(zhuǎn)化生成蘋果酸鈣，轉(zhuǎn)化率高達(dá)99.9%;周小燕等［5］使用L-蘋果酸高產(chǎn)突變株曲霉N1-14'在5 L罐上發(fā)酵120 h，L-蘋果酸產(chǎn)量達(dá)105.88 g/L，平均產(chǎn)生速率0.883 g/(L·h)，糖酸轉(zhuǎn)化率78.43%。

圖1 野生大腸桿菌厭氧混合酸發(fā)酵途徑Fig.1 Matabolic pathway of anaerobic mixed acid fermentation in wide-type E.coli

大腸桿菌遺傳背景清楚、易于進(jìn)行代謝調(diào)控，操作簡便，在厭氧條件下進(jìn)行混合酸發(fā)酵(圖1)，可發(fā)酵糖生成甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸和乙醇等產(chǎn)物。通過代謝工程和基因敲除技術(shù)對大腸桿菌代謝途徑進(jìn)行改造，可消除副產(chǎn)物的積累，提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量。如 Zhou等［6］和 Jantama等［7］利用基于FLP/FRT重組酶系統(tǒng)的基因敲除技術(shù)對大腸桿菌的代謝途徑進(jìn)行改造，獲得生產(chǎn)不同物質(zhì)的重組大腸桿菌，其產(chǎn)物包括乙醇、丙酮酸、乳酸和琥珀酸等?；诖搜芯克悸?，在大腸桿菌中構(gòu)建L-蘋果酸的合成途徑，同時消除雜酸的影響，有可能獲得較高的產(chǎn)量與轉(zhuǎn)化率。

筆者以所在實(shí)驗室前期構(gòu)建的產(chǎn)琥珀酸重組大腸桿菌 E.coli B0013-1050［8］(敲除乙酸激酶、磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因ackA-pta、乳酸脫氫酶基因ldhA、丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB、乙醇脫氫酶基因adhE和酶IICBGlc編碼基因ptsG)為出發(fā)菌株，利用Red同源重組結(jié)合Xer/dif重組技術(shù)［9－10］繼續(xù)敲除富馬酸酶基因和蘋果酸酶基因，構(gòu)建1條葡萄糖-PEP-草酰乙酸-L-蘋果酸的合成途徑，以實(shí)現(xiàn)L-蘋果酸在大腸桿菌中的積累。在此基礎(chǔ)上，通過克隆表達(dá)來源于黃曲霉的蘋果酸脫氫酶基因，強(qiáng)化合成途徑，進(jìn)一步提高L-蘋果酸的轉(zhuǎn)化率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

重組菌株 E.coli 2010、E.coli 2020、E.coli 2030、E.coli 2040和重組菌E.coli B0013-1050由筆者所在實(shí)驗室研究人員構(gòu)建。

質(zhì)粒:質(zhì)粒pSK-difGm和同源重組的協(xié)助質(zhì)粒pKD46、質(zhì)粒pNpheA保藏于筆者所在實(shí)驗室;重組 質(zhì)粒 pMD18-T-fumB'::difGm、pMD18-T-fumC'::difGm、 pMD18-T-maeB'::difGm、pUC19-pNmdh、pBR322-pNmdh 和 pTH18-pNmdh、pMD18-T-maeB'::difGm-pNmdh均為筆者所在研究課題組研究人員構(gòu)建。

1.1.2 引物

本研究課題設(shè)計的引物(表1)均交由上海生工生物工程公司代為合成。

1.1.3 工具酶和試劑

所用 DNA限制性內(nèi)切酶 EcoRI、BamHI、SmaI、HindIII和 KpnI，Taq DNA 聚合酶，反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自Fermentas公司;T4 DNA連接酶、pMD18-T simple vector、pfu高保真DNA聚合酶均為寶生生物工程有限公司產(chǎn)品;小量質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖?、小量DNA片段純化回收試劑盒和小量DNA片段膠回收試劑盒為北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品;L-阿拉伯糖購自上海生工生物工程公司;酵母提取物和胰蛋白胨為Oxoid公司產(chǎn)品;其他試劑藥品均為國產(chǎn)分析純。

表1 本研究中所用引物Table 1 Primers used in this research

1.1.4 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10，酵母浸出物5，NaCl 10。配制固體培養(yǎng)基時加入15 g/L瓊脂粉。

M9 培養(yǎng)基(g/L):Na2HPO4·12H2O 15.12，KH2PO43.0，NaCl 0.5，NH4Cl 1.0。使用時需按體積分?jǐn)?shù)0.1%的量補(bǔ)加Mg2+(1 mol/L)和微量元素，并添加適量葡萄糖溶液作為C源。

微量元素(mmol/L):FeCl3·6H2O 8.88，CoCl2·6H2O 1.26，CuCl2·2H2O 0.88，ZnCl22.20，Na2MoO4·2H2O 1.24，H3BO31.21，MnCl2·4H2O 2.5。

抗生素:氨芐青霉素，終質(zhì)量濃度100 μg/mL;慶大霉素，終質(zhì)量濃度30 μg/mL;卡那霉素，終質(zhì)量濃度 30 μg/mL。

1.2 方法

1.2.1 目標(biāo)基因的敲除

利用Red同源重組結(jié)合Xer/dif重組技術(shù)依次敲除富馬酸酶基因fumB和 fumC，蘋果酸酶基因sfcA和maeB。參照文獻(xiàn)［9］的基因敲除方法，依次構(gòu)建制備在dif-Gm-dif片段左右?guī)в心繕?biāo)基因上下游各200 bp左右同源臂的突變盒。將已經(jīng)導(dǎo)入質(zhì)粒pKD46的大腸桿菌目標(biāo)菌株在含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入L-阿拉伯糖誘導(dǎo)使其產(chǎn)生Red重組酶，制備感受態(tài)細(xì)胞，將同源重組片段與感受態(tài)細(xì)胞按適當(dāng)比例充分混合，電擊轉(zhuǎn)化并后培養(yǎng)1 h，涂布氨芐青霉素和慶大霉素的雙抗平板，30℃培養(yǎng)，挑選陽性轉(zhuǎn)化子。以驗證引物對其進(jìn)行驗證。將驗證結(jié)果正確的菌株30℃下進(jìn)行傳代，使細(xì)胞內(nèi)Xer重組酶系統(tǒng)發(fā)揮作用自動識別dif位點(diǎn)，切除dif位點(diǎn)間的抗性基因，完成目的基因的敲除。

1.2.2 發(fā)酵及產(chǎn)物檢測

搖瓶發(fā)酵:重組菌經(jīng)平板活化，挑取單菌落接入LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min培養(yǎng)10～12 h，離心收集菌體，加入適量M9重懸，轉(zhuǎn)接M9培養(yǎng)基，葡萄糖初始質(zhì)量濃度5 g/L，37℃、200 r/min培養(yǎng)12 h。補(bǔ)加葡萄糖溶液至糖質(zhì)量濃度到30 g/L，以50 g/L的量加入CaCO3，塞上硅膠塞，轉(zhuǎn)入?yún)捬醢l(fā)酵，37℃、200 r/min發(fā)酵36 h。

15 L罐發(fā)酵:重組菌的活化和轉(zhuǎn)接與搖瓶發(fā)酵一致，M9中培養(yǎng)12 h后，作為發(fā)酵罐的種子液。發(fā)酵罐裝液量為6 L，接種量為5%，發(fā)酵溫度37℃，初始葡萄糖質(zhì)量濃度5 g/L，通氣量3 L/min，攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min，好氧培養(yǎng)使菌體生長，適時調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速(200～500 r/min)使得溶解氧體積分?jǐn)?shù)大于30%，以NH3H2O控制pH為7。有氧培養(yǎng)至菌體濃度達(dá)到最大，停止通氣，攪拌速率降為100 r/min，進(jìn)入?yún)捬蹀D(zhuǎn)化階段。按6 g/L加入NaHCO3，并以2.4 mol/L K2CO3和1.2 mol/L KOH溶液代替NH3H2O控制pH為7，37℃恒溫厭氧發(fā)酵30 h。

產(chǎn)物檢測:葡萄糖濃度使用生物傳感分析儀(山東省科學(xué)院生物研究所)檢測;有機(jī)酸產(chǎn)量由高效液相色譜測定儀，泵為Dionex P680，紫外檢測器為Dionex UVD170U，色譜柱為反向 C18色譜柱Nucleosil 100-5 C18，液相檢測條件參照文獻(xiàn)［11］。

1.2.3 黃曲霉總RNA的提取及cDNA的制備

黃曲霉總RNA的提取方法參照文獻(xiàn)［12］，處理過后的總RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR，得到cDNA，用于蘋果酸脫氫酶基因mdh的PCR擴(kuò)增。

1.2.4 黃曲霉蘋果酸脫氫酶基因mdh在重組菌中的表達(dá)

以質(zhì)粒pNpheA(含有組成型啟動子PN25)和黃曲霉cDNA為模版，通過重疊PCR擴(kuò)增得到帶有啟動子PN25的mdh基因，連接不同拷貝數(shù)載體質(zhì)粒(pUC19、pBR322和pTH18)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC19-pNmdh、pBR322-pNmdh 和 pTH18-pNmdh，并導(dǎo)入重組菌中進(jìn)行表達(dá)。

2 結(jié)果與討論

2.1 基因敲除重組菌的構(gòu)建結(jié)果

圖2為基因sfcA、fumB、fumC和maeB敲除驗證結(jié)果。擴(kuò)增sfcA基因時，先后使用2對不同的上下游引物進(jìn)行PCR，但未得到任何擴(kuò)增產(chǎn)物，推測sfcA基因已被敲除，再設(shè)計引物sfcA1和sfcA2，將目的基因包括其上下游各300 bp左右一起擴(kuò)增，但PCR結(jié)果只有約200 bp，之后以野生菌E.coli B0013染色體為模板，PCR結(jié)果與預(yù)期(2379 bp)相符合，驗證結(jié)果見圖2(a)。由圖2(a)可知:sfcA基因已被敲除，原因可能是在前期菌株改造過程中，某個突變盒的同源臂與該基因有較高同源性，導(dǎo)致基因同時被敲除。

圖2 基因敲除驗證Fig.2 Identification of gene knockout

基因fumB、fumC和maeB的敲除驗證見圖2(c)～圖2(d)，使用相同引物對出發(fā)菌株和基因敲除菌株進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物的大小有明顯差異，證明目標(biāo)基因片段已從染色體上刪除。對3株基因敲除重組菌分別命名為 E.coli 2010、E.coli 2020和E.coli 2030。對于fumA基因，考慮到其主要在有氧條件下作用［13］，為保證菌體在有氧條件下的正常生長，本研究未對其進(jìn)行敲除。

2.2 重組菌的生理特性與發(fā)酵實(shí)驗結(jié)果

利用Red同源重組系統(tǒng)結(jié)合Xer/dif重組酶系統(tǒng)，成功構(gòu)建1株富馬酸酶基因(fumB和fumC)和蘋果酸酶基因(sfcA和maeB)重疊缺失突變株E.coli 2030，將該重組菌分別于LB和M9培養(yǎng)基中培養(yǎng)，測定600 nm處吸光值A(chǔ)600，以E.coli B0013-1050為對照菌株，繪制生長曲線，結(jié)果見圖3。由圖3可知:所構(gòu)建的重組菌的生長狀況對比于出發(fā)菌株沒有太大差別，表明敲除fumB、fumC和maeB基因并不會對菌體的好氧生長產(chǎn)生影響。

圖3 E.coli B0013-1050及其突變株E.coli 2030的生長特性比較Fig.3 Aerobic growth comparison bewteen E.coli B0013-1050 and its mutant 2030 in LB medium and M9 medium supplemented with 5 g/L glucose

對重組菌E.coli 2010、2020和2030進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗，以出發(fā)菌E.coli B0013-1050作為對照，發(fā)酵結(jié)果見表2。由表2可知:敲除基因fumB的重組菌E.coli 2010厭氧發(fā)酵的主要產(chǎn)物是丙酮酸和琥珀酸，和出發(fā)菌相比較，琥珀酸的產(chǎn)量下降，葡萄糖-琥珀酸轉(zhuǎn)化率由出發(fā)菌的38.9%下降為26%。而繼續(xù)敲除fumC基因的重組菌E.coli 2020的琥珀酸產(chǎn)量卻只有微弱的下降，并未到達(dá)預(yù)期中完全消除琥珀酸積累的目的。

表2 基因敲除重組菌搖瓶發(fā)酵結(jié)果Table 2 Fermentation results ofrecombinant strains with gene knockout in shake flask

與之前2株重組菌相比，繼續(xù)敲除蘋果酸酶基因的重組菌E.coli 2030發(fā)酵產(chǎn)物中，琥珀酸的轉(zhuǎn)化率變化不大，而丙酮酸的轉(zhuǎn)化率下降，最終生成蘋果酸1.76 g/L，葡萄糖-蘋果酸轉(zhuǎn)化率為17.6%。

重組菌2030在15 L罐中發(fā)酵，考察其產(chǎn)酸能力，發(fā)酵結(jié)果如圖4所示。由圖4可知:厭氧發(fā)酵30 h，耗糖24 g/L，最終產(chǎn) L-蘋果酸 12.5 g/L，葡萄糖-蘋果酸轉(zhuǎn)化率為 52.1%，生產(chǎn)強(qiáng)度 0.42 g/(L·h)。丙酮酸轉(zhuǎn)化率下降到19.3%。發(fā)酵液中還檢測到琥珀酸和少量的乳酸。

圖4 重組大腸桿菌E.coli 2030在15 L發(fā)酵罐中發(fā)酵產(chǎn)酸情況Fig.4 Acid production of recombinantE.coli 2030 in a 15-L bioreactor

2.3 蘋果酸脫氫酶基因mdh表達(dá)量對L-蘋果酸產(chǎn)率的影響

蘋果酸脫氫酶(malate dehydrogenase，MDH，EC 1.1.1.37)是筆者所構(gòu)建的L-蘋果酸合成途徑中的一個關(guān)鍵酶，通過強(qiáng)化MDH的表達(dá)，可引導(dǎo)代謝流更多地走向L-蘋果酸合成途徑，提高目的產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率。Peleg等［14］發(fā)現(xiàn)在黃曲霉中L-蘋果酸的合成主要來自于草酰乙酸，蘋果酸脫氫酶在L-蘋果酸生產(chǎn)中起到了重要作用。本文此前構(gòu)建的合成途徑也是由草酰乙酸生成L-蘋果酸，因此克隆了來源于黃曲霉的蘋果酸脫氫酶基因mdh，連接至不同拷貝數(shù)載體，并在重組菌E.coli 2030中進(jìn)行表達(dá)，考察其表達(dá)量對L-蘋果酸產(chǎn)率的影響。

繪制含不同拷貝數(shù)質(zhì)粒的重組菌在M9培養(yǎng)基中的生長曲線，結(jié)果見圖5。由圖5可知:在相同的培養(yǎng)條件下，攜帶高拷貝質(zhì)粒的重組菌所能達(dá)到的菌體濃度明顯小于攜帶中低拷貝數(shù)質(zhì)粒的重組菌，這是因為更多的能量被用于蛋白質(zhì)合成而影響了菌體的生長。其余2個重組菌的生長狀況相似，對比于重組菌E.coli 2030，最終的菌體濃度也沒有太大差別。這表明蘋果酸脫氫酶的表達(dá)量應(yīng)控制在中低水平，過高則會影響菌體的生長。

以菌株E.coli 2030作為對照，對含不同拷貝數(shù)質(zhì)粒的重組菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗，發(fā)酵結(jié)果見表3。由表3可知:厭氧發(fā)酵36 h后，相較于對照菌，L-蘋果酸的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率都有不同程度的提高，并且隨著拷貝數(shù)的降低，L-蘋果酸的轉(zhuǎn)化率也逐漸升高。上述結(jié)果表明，想要獲得較好的強(qiáng)化作用，需要將蘋果酸脫氫酶的表達(dá)量控制在較低的水平，而不是越高越好。

圖5 攜帶不同拷貝數(shù)質(zhì)粒的重組菌生長曲線Fig.5 Growth curves of recombinant strains harboring recombinant plasmids with different copy numbers

表3 含有不同拷貝數(shù)質(zhì)粒的重組菌產(chǎn)L-蘋果酸能力的比較Table 3 L-malic acid production comparison bewteen recombinant strains harboring recombinant plasmids with different copy numbers

2.4 重組菌E.coli 2040的構(gòu)建及其發(fā)酵實(shí)驗結(jié)果

為了實(shí)現(xiàn)蘋果酸脫氫酶基因的穩(wěn)定遺傳并控制其表達(dá)量在較低水平，將mdh基因整合表達(dá)于重組菌中。根據(jù)之前的基因敲除方法，將同源重組突變盒maeB'::difGm連接至pMD18-T-maeB'::pNmdh，構(gòu)建突變盒 maeB'::difGm-pNmdh，使用該突變盒在敲除maeB基因的同時，將基因mdh整合于重組大腸桿菌染色體上?；蛘系尿炞C結(jié)果見圖6。由圖6可知，mdh已整合于重組菌染色體上，將該菌命名為E.coli 2040。

圖7為E.coli 2040在15 L罐中厭氧發(fā)酵結(jié)果。由圖7可知:厭氧發(fā)酵30 h，耗糖23.2 g/L，最終產(chǎn)L-蘋果酸14 g/L，葡萄糖-蘋果酸轉(zhuǎn)化率為60.3%，生產(chǎn)強(qiáng)度0.47 g/(L·h)。

對于利用大腸桿菌直接發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋果酸，國內(nèi)外學(xué)者已有一定的研究，Zhang等［15］以產(chǎn)琥珀酸重組大腸桿菌KJ073為出發(fā)菌，繼續(xù)敲除富馬酸酶fumAC和fumB，延胡索酸還原酶frdBC，蘋果酸酶sfcA和maeB，得到菌株XZ658，在3 L罐中，經(jīng)兩段式發(fā)酵72 h，耗糖32.8 g/L，最終產(chǎn)蘋果酸34 g/L，葡萄糖-蘋果酸轉(zhuǎn)化率為103.8%，生產(chǎn)強(qiáng)度0.47 g/(L·h)，其他的雜酸只有少量的琥珀酸、乳酸和乙酸(1 g/L左右)，是目前產(chǎn)L-蘋果酸大腸桿菌中轉(zhuǎn)化率最高的1株。但由于fumA基因的缺失，重組菌的生長受到影響，導(dǎo)致發(fā)酵周期的延長(有氧培養(yǎng)16 h，發(fā)酵周期72 h)。本文菌株擁有較好的生長性能，可為后期的厭氧轉(zhuǎn)化提供較高的初始菌體濃度，并縮短整個發(fā)酵周期，在此基礎(chǔ)上繼續(xù)對菌株進(jìn)行改造，提高蘋果酸的產(chǎn)量及轉(zhuǎn)化率，則可獲得性能更為優(yōu)良的菌株。

圖6 mdh基因整合表達(dá)的驗證Fig.6 Identification of genemadh integrant expression

圖7 重組大腸桿菌E.coli 2040在15 L發(fā)酵罐中發(fā)酵產(chǎn)酸情況Fig.7 Acid production of recombinantE.coli 2040 in a 15-L bioreactor

3 結(jié)論

基于重組大腸桿菌E.coli B0013-1050的琥珀酸生成途徑，利用Red同源重組結(jié)合Xer/dif重組系統(tǒng)敲除富馬酸酶基因fumB和fumC，蘋果酸酶基因sfcA和maeB，成功構(gòu)建L-蘋果酸合成途徑，經(jīng)15 L罐發(fā)酵產(chǎn)L-蘋果酸12.5 g/L，葡萄糖-蘋果酸轉(zhuǎn)化率為52.1%，主要雜酸為丙酮酸及琥珀酸;之后引入來源于黃曲霉的蘋果酸脫氫酶，強(qiáng)化該途徑，使L-蘋果酸產(chǎn)量提高到14 g/L，葡萄糖-蘋果酸轉(zhuǎn)化率提高到60.3%，同時降低了丙酮酸及琥珀酸的轉(zhuǎn)化率。

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