新型柱前衍生試劑分析草甘膦的高效液相色譜研究

方 芳，魏榮卿，劉曉寧，李壽椿

(1.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，南京 211800;2.南京中意化工技術(shù)開發(fā)研究所，南京 210009)

草甘膦(glyphosate，PMG)，化學(xué)名稱為 N-膦羧基甲基甘氨酸，是一種廣譜、非選擇性、內(nèi)吸傳導(dǎo)性強(qiáng)的除草劑［1］，它具有良好的除草性能，近年來在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域得到越來越多的應(yīng)用。目前測定草甘膦的方法主要有分光光度法［2］、毛細(xì)管電泳(CE)［3］、離子色譜法［4］、氣相色譜法(GC)［5］、液相色譜法(LC)等，而柱前衍生液相色譜法［6－8］是最常用的方法之一，柱前衍生液相色譜法中熒光衍生檢測高效液相色譜法［9］、蒸發(fā)光散射檢測高效液相色譜法［10］等所采用的儀器或試劑普及度較低，而紫外檢測柱前衍生高效液相色譜法［6，11－12］則易于常規(guī)檢測。用于紫外檢測的柱前衍生化試劑有對甲氧基苯磺酰氯(MOBS-Cl)［6］、對甲基苯磺酰氯(TsCl)［11］、鄰硝基苯磺酰氯(NBSC)［12］、對硝基苯甲酰氯(PNBC)［13］，3，5-二硝基-4-氯三氟甲苯(CNBF)［7］等，這些試劑存在反應(yīng)溫度高，或反應(yīng)時間長，或反應(yīng)后需萃取除去過量的試劑等缺點。針對以上缺點欲探索一種反應(yīng)活性高、操作簡單、衍生產(chǎn)物穩(wěn)定的柱前衍生化試劑。

2，5-二甲氧基苯磺酰氯(DMOSC)常用于藥物合成，但作為柱前衍生化試劑分析胺基化合物從未報道，本文采用DMOSC為新型柱前衍生化試劑，草甘膦為仲胺化合物代表，探索一種衍生反應(yīng)條件溫和、靈敏度高的高效液相檢測草甘膦的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Summit型Dionex(戴安)高效液相色譜儀，色譜系統(tǒng)由P680 HPLC泵、UVD-170U可變波長紫外檢測器、8125型進(jìn)樣裝置和柱溫箱TC-100組成。工作站:美國戴安Chromeleon公司。

DMOSC(98%，Alfa Aesar公司)，PMG標(biāo)準(zhǔn)品(99.2%，上海農(nóng)藥研究所);甲醇(HPLC級，Merck公司)，硼砂、Na2HPO4、無水乙醇均為市售分析純;水為超純水。

1.2 液相色譜條件

Kromasil C18 柱(5 μm，4.6 mm ×250 mm);流動相:V(A甲醇)∶V(B乙腈)∶V(C磷酸鹽緩沖溶液(0.02 mol/L，pH 5.5))=15∶5∶80;流速 1.0 mL/min;柱溫30℃;檢測波長220 nm;進(jìn)樣量20 μL。

1.3 衍生方法

分別將PMG標(biāo)樣溶于硼砂緩沖溶液(0.2 mol/L，pH 10.0)中，配制 PMG 溶液(0.33 mg/mL)，DMOSC溶于甲醇配成溶液(5.54 mg/mL)，取前后兩者體積比2∶1混合后，置于35℃恒溫水浴中反應(yīng)15 min，取出用0.45 μm濾膜過濾，按1.2液相條件檢測。在 n(DMOSC)∶n(PMG)=6∶1、35 ℃、15 min、pH 10.0條件下進(jìn)行衍生，化學(xué)反應(yīng)式見圖1。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

用硼砂緩沖溶液(0.2 mol/L，pH 10.0)配制PMG的儲備液(100 μg/mL)，分別取儲備液 0.05、0.15、0.25、0.35、0.45、0.55、0.65、0.75、0.90 和 1.0 mL 于10個試管，用緩沖溶液定容至1.0 mL(草甘膦質(zhì)量濃度為5～100 μg/mL);DMOSC 10.2 mg溶于6 mL甲醇中，分別取0.5 mL于上述10個試管中，混合(1.5 mL/管)，按優(yōu)化后的條件衍生并檢測。

圖1 2，5-二甲氧基苯磺酰氯與草甘膦化學(xué)反應(yīng)式Fig.1 Reaction of 2，5-dimethoxybenzenesulfonyl chloride and glyphosate

2 結(jié)果與討論

2.1 衍生化反應(yīng)時間對衍生效率的影響

按衍生方法1.3考察衍生反應(yīng)時間(1、5、10、20和30 min)對衍生效率的影響，反應(yīng)10 min時的色譜圖見圖2。由圖2可知:PMG與DMOSC很容易反應(yīng)，反應(yīng)速度很快，10 min已基本完成反應(yīng)，相比于其他PMG衍生化反應(yīng)［11］，該反應(yīng)時間短，為保障反應(yīng)完全，故確定15 min為最佳反應(yīng)時間。

圖2 草甘膦衍生反應(yīng)液相色譜Fig.2 HPLC chromatogram of reaction solution

2.2 衍生化反應(yīng)的溫度對衍生效率的影響

在反應(yīng)pH為9.0、反應(yīng)時間為15 min時，考察不同反應(yīng)溫度(25、30、35、40、45 和50 ℃)對衍生效率的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可知:隨著反應(yīng)溫度的升高，衍生產(chǎn)物的量增加，35℃后衍生產(chǎn)物量隨著溫度的進(jìn)一步升高反而減少。由此說明，DMOSC作為衍生化試劑相比于其他衍生試劑［6，11］表現(xiàn)為較低溫度下的良好反應(yīng)活性，這對于一些對溫度敏感的生物活性物質(zhì)的衍生化檢測有重要的應(yīng)用意義。取35℃為最佳反應(yīng)溫度。

圖3 反應(yīng)溫度對衍生反應(yīng)的影響Fig.3 Effects of reaction temperature on derivatization

2.3 衍生化反應(yīng)的pH對衍生效率的影響

在反應(yīng)溫度35℃、反應(yīng)15 min時，考察衍生不同反應(yīng)pH(pH 8.0～11.0)對衍生反應(yīng)效率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 pH對衍生反應(yīng)的影響Fig.4 Effects of pH on derivatization

由圖4可知:當(dāng)pH較低時，反應(yīng)釋放的HCl會抑止反應(yīng);而當(dāng)反應(yīng)pH較高時，則易加快衍生試劑的水解，只有當(dāng)pH 10.0至10.5時，此弱堿環(huán)境不僅可以中和衍生釋放的HCl，且不易造成衍生試劑的水解，因此，選擇pH=10.0為最佳pH。

2.4 衍生試劑的量對衍生效率的影響

通過改變衍生反應(yīng)中添加的DMOSC的量來考察反應(yīng)摩爾比對衍生效率的影響。結(jié)果表明:隨著摩爾比的增加，衍生產(chǎn)物的量增加，同時衍生試劑的水解量明顯增加，考慮既提高檢測靈敏度，又避免大量衍生試劑水解浪費，選擇衍生反應(yīng)的摩爾比為1∶6。

2.5 精密度實驗

相同條件下，平行反應(yīng)5次，測定每次的峰面積，并求出其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.98%，結(jié)果表明該方法有較好的重復(fù)性。

2.6 衍生反應(yīng)液穩(wěn)定性考察

將反應(yīng)好的衍生產(chǎn)物溶液過濾，室溫儲存3個月后檢測，結(jié)果顯示衍生產(chǎn)物的峰形、峰面積、保留時間等無明顯差異，表明衍生產(chǎn)物具有良好的穩(wěn)定性。

2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及回收率實驗

按1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制法結(jié)果表明PMG質(zhì)量濃度在5～100 μg/mL范圍內(nèi)，PMG衍生產(chǎn)物峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=Y=0.205 3x+1.427 8，R2=0.996 2，以信噪比 S/N=3計算檢出限，其最小檢出限為0.067 μg/mL。

將草甘膦標(biāo)準(zhǔn)樣添加質(zhì)量在空白水體中，添加質(zhì)量濃度分別為45、65和75 μg/mL，然后衍生化，HPLC測定。所得水體中草甘膦的回收率分別為101.7、103.7和96.4%。由此可知該方法準(zhǔn)確度很好，符合農(nóng)藥殘留分析的要求。

3 結(jié)論

研究了新型的伯仲胺基衍生化試劑2，5-二甲氧基苯磺酰氯與仲胺草甘膦的柱前反應(yīng)，用紫外-高效液相其衍生產(chǎn)物進(jìn)行檢測。通過一系列的衍生條件優(yōu)化得知:該方法操作簡單，反應(yīng)時間短，反應(yīng)條件溫和，靈敏度高，在35℃下、15 min即可完成反應(yīng)，而且衍生產(chǎn)物穩(wěn)定，反應(yīng)重復(fù)性好，HPLC色譜分離條件簡單。綜合考慮，該方法優(yōu)于其他柱前衍生方法，同時相對于其他衍生劑來說，該試劑同樣適用于其他含有胺基的生物活性物質(zhì)的衍生化反應(yīng)，是一種應(yīng)用前景良好的衍生試劑。

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