功能化離子液體化學修飾豬胰脂肪酶的催化性能

初旭明，賈 儒，楊 姣，黃 和，胡 燚，2

(1.南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院，南京211800;2.材料化學工程國家重點實驗室，南京210009)

脂肪酶(lipase，EC 3.1.1.3)主要是指一類能夠催化甘油三酯水解生成脂肪酸、甘油和甘油單酯或二酯的酶［1－2］，廣泛應(yīng)用于水解或醇解、酯合成、酯交換、內(nèi)酯合成、多肽合成、高聚物合成及立體異構(gòu)體拆分等有機合成反應(yīng)，是目前用途最廣泛的酶催化劑之一［3］。豬胰脂肪酶(porcine pancreas lipase，PPL)是一類重要的脂肪酶，在食品、化妝品、醫(yī)藥、洗滌劑和畜牧業(yè)等領(lǐng)域中均有廣泛應(yīng)用［4］。然而，PPL的應(yīng)用仍然存在一些不足，如一般具有實際應(yīng)用價值的目標化合物并不是它的天然底物;PPL活力不高，在有機溶劑、高溫、極端pH等非天然環(huán)境下極易失活等，這些不利因素限制了PPL在工業(yè)上進一步的廣泛應(yīng)用。因此，對PPL進行分子改性以強化其催化性能，為工業(yè)應(yīng)用提供活性更高、穩(wěn)定性更好、環(huán)境耐受性更強的新酶品種，具有重要的實際應(yīng)用價值［5］。

化學修飾具有廉價、周期短、實驗室可行、容易創(chuàng)造新型的酶學性質(zhì)等優(yōu)點，是對脂肪酶進行分子改性的一種重要手段［6－7］。雖然化學修飾 PPL已經(jīng)取得了一定的研究進展，但仍然局限于脂肪酸、氨基酸、酸酐、聚乙二醇(PEG)和多糖等常用修飾劑的研究，修飾酶的催化活性、穩(wěn)定性、耐有機溶劑性等性能往往不能同時得到有效的改善以滿足反應(yīng)的需要。

離子液體近年來在生物催化領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛，脂肪酶、蛋白酶、糖苷酶、醇氰酶、氧化還原酶等多種酶都在離子液體中顯示出了很好的穩(wěn)定性［8］。在離子液體中酶催化的區(qū)域、對映體選擇性往往都有所增加，尤其作為高極性底物的酶催化反應(yīng)介質(zhì)，離子液體顯示出了巨大的潛力［9］。筆者所在課題組將功能化離子液體作為酶固定化載體材料 SBA-15 的表面修飾劑［10－12］，結(jié)果表明修飾載體固定化的酶對溫度、pH等的穩(wěn)定性得到了有效提升，而且相對活力較游離酶有了較大提高。在固定化方法中，離子液體作為載體修飾劑。近幾年，Bekhonche 等［13－14］首次提出了離子液體修飾酶的新型化學修飾方法，用含羥基的咪唑、吡咯等離子液體修飾甲酸脫氫酶，修飾酶的活性和穩(wěn)定性得到了顯著提升。這些研究說明離子液體不僅可以作為反應(yīng)介質(zhì)用于酶催化反應(yīng)中，還可以分別用作固定化載體及酶分子自身的修飾劑，目前還沒有其他用功能化離子液體修飾脂肪酶的報道。本文以PPL為例，希望發(fā)展一種酶分子改造的新方法。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

PPL購自Sigma公司并在0～4℃下保存，酶的蛋白質(zhì)含量為9.3%，以三乙酸甘油酯為底物時比酶活力為362 U/g(45℃、pH 7.5)。3種離子液體氯化1-羧甲基-3-甲基咪唑(99%)、氯化1-羧甲基-3-乙基咪唑 (99%)、氯化 1-羧甲基-3-丁基咪唑(99%)購自上海成捷化學有限公司。1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(98%)、N-羥基琥珀酰亞胺(98%)、嗎啉乙磺酸(97%)購自阿拉丁試劑公司。其余試劑購自國藥集團化學試劑有限公司，均為分析純。

1.2 離子液體的活化

取0.001 mol的離子液體，加入0.001 2 mol 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺及0.111 5 mol N-羥基琥珀酰亞胺，在5 mL的嗎啉乙磺酸溶液中，室溫攪拌反應(yīng)2 h后停止［5］。

1.3 活化的離子液體修飾PPL

取2 g PPL用去離子水溶解，向酶溶液中緩慢加入活化的離子液體，在0～4℃下，磁力攪拌6 h后，在去離子水中透析24 h備用。修飾度的測量通過三硝基苯磺酸法才測定［15］。

1.4 蛋白質(zhì)含量測定

按照Bradford［16］的方法，以牛血清蛋白作為標準蛋白質(zhì)繪制標準曲線。測定酶液的吸光值，根據(jù)標準曲線計算蛋白濃度。

1.5 酶活的測定

2)酶活測定 取10 mL上述制備的三乙酸甘油酯乳化液于100 mL錐形瓶中，再加入15 mL磷酸鹽緩沖液(pH 7.5)，于50℃、150 r/min下預熱5 min，然后向其中加入酶開始反應(yīng)。反應(yīng)10 min后取出，立即加入15 mL乙醇終止反應(yīng)。用0.025 mol/L的NaOH溶液滴定，記錄NaOH的消耗量。在一定條件下，每分鐘酶催化三乙酸甘油酯生成1 μmol乙酸所需要的酶量，定義為一個酶活單位(U)。

1.6 最適溫度及最適pH的檢測

1)最適溫度 調(diào)節(jié)反應(yīng)緩沖液pH為7.0，分別在30、35、40、45、50、55、60 和 65 ℃ 下水浴反應(yīng) 10 min，取出測定酶活。

2)最適pH 調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH分別為6.0、6.5、7.0、7.5 和8.0，50 ℃下水浴反應(yīng) 10 min，取出測定酶活。

1.7 酶的熱穩(wěn)定性

將酶置于50℃水浴中保溫，分別在0、0.5、1、2、4、6和8 h取出，冷卻至室溫，再測定酶活。酶活測定方法同1.5。設(shè)保溫0 h時的游離酶的初始酶活為100%。

1.8 有機溶劑耐受性

在酶活測定的反應(yīng)體系中，加入不同濃度的有機溶劑，測定修飾前后PPL在有機溶劑中的催化穩(wěn)定性，設(shè)不含有機溶劑體系游離酶的初始酶活為100%。

1.9 紫外光譜測定

室溫下，取相同濃度的 PPL、PPL-M、PPL-E和PPL-B在紫外可見分光光度計上分別測定其紫外可見吸收光譜，測定范圍為240～340 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 水解活力的考察

表1為經(jīng)修飾后的酶與PPL的表觀比酶活力的數(shù)據(jù)。

表1 酶的水解活力Table 1 Hydrolytic activity of enzymes

由表1可知:豬胰脂肪酶在經(jīng)過修飾之后，活力有明顯的提高，說明離子液體修飾脂肪酶的方法有利于水解活力的提高。其中離子液體修飾的酶，隨著修飾度的增加活力增大，含短鏈的修飾有更好的水解活力，是游離酶的1.74倍，而鄰苯二甲酸酐對PPL的修飾只提高了25%的水解活力［17］。隨著修飾劑的鏈長的增大，活力呈降低的趨勢。

在此格式中，就“吃虧/上當”的語法特點來說，有些名詞化特點；就其意義說有些事物化，“吃虧/上當”不再表示一種動作，而表示一種抽象的事物?！暗€不能因此說它們已經(jīng)取得了名詞的資格”(呂冀平，2003)，前面的分析顯示它們?nèi)匀淮蟛糠值乇Ａ糁鴦釉~的語法特點，同時此格式還受其他語法成分的牽制，如“買不了”后所接名詞多含褒義或中性的色彩。這是此方法所不能闡釋清楚的。

2.2 最適溫度的考察

根據(jù)經(jīng)典酸堿滴定的方法，在不同溫度下考察酶水解三乙酸甘油酯特性，結(jié)果見圖1。由圖1可知:原酶最適反應(yīng)溫度為45℃左右;經(jīng)離子液體修飾后，PPL的最適溫度向高溫方向移動至55℃。與PPL相比，修飾后的PPL對溫度的適應(yīng)范圍更廣。經(jīng)過修飾后的酶對在高溫區(qū)相對游離酶更加趨于平緩，該點證明酶的離子液體修飾有助于提高溫度的耐受性。

圖1 溫度對PPL活力的影響Fig.1 Effects of temperature on activity of PPL

2.3 最適pH的考察

在不同pH條件下考察豬胰脂肪酶的三乙酸甘油酯水解特性，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知:修飾酶及游離酶的最適反應(yīng)pH均為7.5，修飾的PPL在6.0～8.0之間對pH的敏感度明顯降低，離子液體的修飾拓寬了酶的使用范圍。

圖2 pH對修飾酶酶活的影響Fig.2 Effects of pH on activity of modified lipases

2.4 熱穩(wěn)定性的考察

熱穩(wěn)定性是酶催化工業(yè)化應(yīng)用的一個重要因素。圖3為酶的熱穩(wěn)定性實驗結(jié)果。由圖3可知:游離酶的熱穩(wěn)定性較差，酶活下降快。在保溫2 h后，酶活僅為初始酶活的20%。PPL-M、PPL-E及PPL-B的熱穩(wěn)定性均顯著提高;在保溫8 h后，殘余酶活仍然保持在游離酶初始酶活的60%以上，尤其是長鏈的離子液體修飾的酶，酶活降低的更緩慢，熱穩(wěn)定性更好。

2.5 有機溶劑對酶活的影響

2.5.1 甲醇對酶活的影響

在pH 7.5、30℃不同甲醇體積分數(shù)的條件下，測定PPL、PPL-M、PPL-E及PPL-B的活力變化，結(jié)果見圖4。

由圖4可知:反應(yīng)體系中加入不同體積分數(shù)的甲醇時，游離酶的相對活力一直在降低。而3種修飾酶的活力則是先升高，在高濃度的含甲醇體系中會下降，這可能是修飾后的酶在低濃度的甲醇中仍能維持構(gòu)象穩(wěn)定，而高濃度的甲醇會破壞部分氫鍵從而造成酶的解折疊。3種酶的變化趨勢比較一致，且普遍高于PPL，3種修飾酶的活力大小順序(從大到小)為 PPL-M、PPL-E、PPL-B，但 PPL-B 的活力在含低濃度的甲醇中增加幅度高于其他2種修飾酶，在含高濃度的甲醇中的活力降低程度要低于其余2種修飾酶。

圖3 修飾酶的熱穩(wěn)定性Fig.3 Thermal stability of modified lipases

圖4 甲醇對酶活的影響Fig.4 Effects of methanol on modified lipases

2.5.2 N，N-二甲基甲酰胺(DMF)對酶活的影響

在pH7.5、30℃不同DMF體積分數(shù)的條件下，測定PPL、PPL-M、PPL-E及PPL-B的活力變化，結(jié)果見圖5。

由圖5可知:在反應(yīng)體系中加入不同體積分數(shù)的DMF時，游離酶的活力一直在降低，而修飾酶均保持了較高的活力，在反應(yīng)體系中存在80%的DMF時，3種修飾酶的活力仍然保持游離酶100%的相對活力以上。3種修飾酶在不同濃度的DMF的反應(yīng)體系中，酶活變化趨勢一致，修飾酶的水解活性均高于原酶PPL。在含低濃度DMF中，PPL-M的酶活高于其他2種修飾酶，在DMF濃度不斷增加中，PPL-B的活力受影響程度最弱，在70%以上的DMF體積分數(shù)中活力下降比例低于其他2種修飾酶，PPL修飾后的耐DMF的性能明顯提高。

圖5 DMF對酶活的影響Fig.5 Effects of DMF on modified lipases

2.6 紫外光譜表征

圖6為脂肪酶PPL、PPL-M、PPL-E及PPL-B的紫外光譜變化圖。

圖6 酶的紫外吸收光譜Fig.6 UV spectra of lipases

由圖6可知:PPL經(jīng)離子液體修飾后，紫外吸收光譜峰型未發(fā)生明顯變化，說明修飾后對PPL的空間結(jié)構(gòu)沒有造成明顯的影響，但原270 nm處的吸收峰發(fā)生輕微紅移，PPL-M、PPL-E及PPL-B的最大吸收波長值分別為271、272及275 nm，修飾酶的紫外吸光值均有所提高。

3 結(jié)論

以3種陰離子的咪唑類離子液體對PPL進行化學修飾，修飾后的PPL水解活力明顯提升，修飾度越高，水解活力越高，且隨著修飾劑的鏈長的增大，活力呈降低的趨勢。與原酶相比，修飾酶的熱穩(wěn)定、有機溶劑中的催化性能等酶學性質(zhì)都得到了提高。

［1］ Hasan F，Shah A A，Hameed A.Industrial applications of microbial lipases［J］.Enzyme Microb Technol，2006，39(2):235-251.

［2］ Yang J K，Guo D Y，Yan Y J.Cloning expression and characterization of a novel thermal stable and short-chain alcohol tolerant lipase from Burkholderia cepacia strain G63［J］.J Mol Catal B:Enzymatic，2007，45(3/4):91-96.

［3］ 胡文靜，譚天偉，王芳.改性殼聚糖固定化脂肪酶的研究［J］.生物工程學報，2007，23(4):667-671.

［4］ Mendes A A，Oliveira P C，de Castro H F.Properties and biotechnological applications of porcine pancreatic lipase［J］.J Mol Catal B:Enzymatic，2012，78:119-134.

［5］ Evran S，Telefoncu A.Modification of porcine pancreatic lipase with z-proline［J］.Prep Biochem Biotechnol，2005，35(3):191-201.

［6］ Díaz-Rodríguez A，Davis B G.Chemical modification in the creation of novel biocatalysts［J］.Curr Opin Chem Biol，2011，15(2):211-219.

［7］ Rodrigues R C，Murcia A B，Lafuente R F.Coupling Chemical modification and immobilization to improve the catalytic performance of enzymes［J］.Adv Synth Catal，2011，353(13):2216-2238.

［8］ Armand M，Endres F，MacFarlane D R，et al.Ionic-liquid materials for the electrochemical challenges of the future［J］.Nature Material，2009，8(6):621-629.

［9］ Zhang Q H，Zhang S G，Deng Y Q.Recent advances in ionic liquid catalysis［J］.Green Chem，2011，13(10):2619-2637.

［10］ Zou B，Hu Y，Yu D H，et al.Immobilization of porcine pancreatic lipase onto ionic liquid modified mesoporous silica SBA-15［J］.Biochem Eng J，2010，539(1):150-153.

［11］ Yang J，Hu Y，Jiang L，et al.Enhancing the catalytic properties of porcine pancreatic lipase by immobilization on SBA-15 modified by functionalized ionic liquid［J］.Biochem Eng J，2013，70:46-54.

［12］ Hu Y，Tang S S，Jiang L，et al.Immobilization of Burkholderia cepacia lipase on functionalized ionic liquids modified mesoporous silica SBA-15［J］.Process Biochem，2012，47(12):2291-2299.

［13］ Bekhouche M，Blum L J，Doumeche B.Ionic liquid-inspired cations covalently bound to formate dehydrogenase improve its stability and activity in ionic liquids［J］.ChemCatChem，2011，3(5):875-882.

［14］ Bekhouche M，Doumeche B，Blum L J.Chemical modification of stem bromelain with anhydride groups to enhance its stability and catalytic activity［J］.J Mol Catal B:Enzymatic，2010，65(3/4):73-78.

［15］ Xue Y，Wu C Y，White C J B，et al.Chemical modification of stem bromelain with anhydride groups to enhance its stability and catalytic activity［J］.J Mol Catal B:Enzymatic，2010，63(3/4):188-193.

［16］ Bradford M.A rapid and sensitive method for the detection of microgram quantities of proteins［J］.Anal Biochem，1976，72:248-254.

［17］ 熊亞紅，蘇健鴻，劉小平.鄰苯二甲酸酐修飾脂肪酶的性能研究［J］.華南農(nóng)業(yè)大學學報，2011，32(2):122-124.