玉米ZmLTP3基因表達(dá)載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化

孫小艷等

摘要：通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入擬南芥（Arabidopsis thaliana）中進(jìn)行過量表達(dá)。PCR及Western-blot分析結(jié)果表明，ZmLTP3基因已轉(zhuǎn)入擬南芥中，并且在大多數(shù)轉(zhuǎn)化植株中穩(wěn)定表達(dá)。

關(guān)鍵詞：玉米（Zea mays）；ZmLTP3基因；擬南芥（Arabidopsis thaliana）；遺傳轉(zhuǎn)化

中圖分類號(hào)：Q782 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）04-0929-03

Construction and Transformation of Maize ZmLTP3 Gene Expression Vector

SUN Xiao-yan，ZHU Yong，ZOU Hua-wen

（College of Agriculture， Yangtze University， Jingzhou 434025， Hubei， China）

Abstract： LTP3 plays important roles in plant physiology. To study the function of a LTP3-like maize（Zea mays） ZmLTP3 gene， the cDNA of ZmLTP3 was constructed into the expression vector pGreen0029 and over-expressed in Arabidopsis thaliana. PCR and Western-blot analysis showed that ZmLTP3 gene was transformed into A. thaliana and expressed in majority transgenic plants.

Key words： maize（Zea mays）； ZmLTP3 gene； Arabidopsis thaliana； transformation

植物轉(zhuǎn)脂蛋白（Lipid transfer proteins，LTPs）是一類小分子量、多基因家族編碼的的堿性蛋白質(zhì)，具備轉(zhuǎn)移磷脂和脂肪酸的能力[1-3]。轉(zhuǎn)脂蛋白分為兩個(gè)亞家族，即LTP1和LTP2。LTP1亞家族成員含有90～95個(gè)氨基酸殘基，分子質(zhì)量為9 ku左右；LTP2亞家族成員通常含有70個(gè)氨基酸殘基，分子質(zhì)量為7 ku左右[4]。轉(zhuǎn)脂蛋白家族成員的結(jié)構(gòu)高度保守：分子內(nèi)部含有兩個(gè)保守的五肽基序（Thr/Ser-X1-X2-Asp-Arg/Lys、Pro-Tyr-X-Ile-Ser）。另外，蛋白質(zhì)分子中都含有8個(gè)保守的半胱氨酸，形成4對(duì)二硫鍵[5]；轉(zhuǎn)脂蛋白分子還含有一個(gè)由4個(gè)α-螺旋形成的疏水洞穴，可以和所轉(zhuǎn)運(yùn)的磷脂或脂肪酸相互作用，從而行使其生物學(xué)功能[6]。

目前為止，已經(jīng)從多種植物中被克隆、鑒定了轉(zhuǎn)脂蛋白基因[7-12]。除了擁有最初認(rèn)為的脂轉(zhuǎn)移功能外，還發(fā)現(xiàn)具有其他多種生物學(xué)功能，如種子脂肪動(dòng)員、體細(xì)胞發(fā)育、蠟物質(zhì)形成、表皮形成、花粉管黏著、抗病等[4，13-19]。相對(duì)于在生物脅迫中的功能而言，轉(zhuǎn)脂蛋白在非生物脅迫中功能的直接證據(jù)還鮮有報(bào)道。

在此前的研究中，課題組相繼從玉米（Zea mays）中克隆了Pto/Pti1信號(hào)傳導(dǎo)途徑的兩個(gè)重要成員ZmPto和ZmPti1基因，過量表達(dá)ZmPto和ZmPti1基因的擬南芥（Arabidopsis thaliana）株系表現(xiàn)出較高的抗鹽性[20，21]。隨后，對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥株系做基因芯片分析。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因擬南芥中LTP3基因（At5g59320）的表達(dá)量相對(duì)于野生型提高了近18倍。這表明LTP3可能是Pto/Pti1信號(hào)系統(tǒng)的下游組分，并且在抗鹽過程中起到非常重要的作用。隨后，從玉米中克隆了擬南芥LTP3基因的同源基因ZmLTP3（GenBank Accession No. JX435819），RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)ZmLTP3可由多種生物和非生物脅迫因子（尤其是高鹽）所誘導(dǎo)（待發(fā)表）。本研究構(gòu)建了植物表達(dá)載體，將ZmLTP3基因轉(zhuǎn)入擬南芥中過量表達(dá)，為研究其生物學(xué)功能提供可能。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料 擬南芥（Columbia 生態(tài)型）、大腸桿菌（E. coli） DH5α、農(nóng)桿菌GV3101、pGEM-T載體、含ZmPti1-dHA序列的酵母表達(dá)載體p426GAL1、含35S-C4DDPK-CBF3-NOS片段的植物表達(dá)載體pGreen0029均由長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院保存。

1.1.2 試劑 DNA 凝膠回收試劑盒購自杭州V-gene生物技術(shù)公司； DNA限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶、ExTaq酶、DNA Marker均購自寶生物工程（大連）有限公司；Anti-HA（3f10）及Peroxidase-conjugated goat anti-rat IgG（H+L）均購自Roche公司；PVDF膜購自Millipore公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。PCR 引物及DNA測(cè)序工作由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 ZmLTP3基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建 設(shè)計(jì)PCR引物（含BamHⅠ和StuⅠ酶切位點(diǎn)）擴(kuò)增pGEM-T載體中ZmLTP3基因序列，BamHⅠ/StuⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物和含ZmPti1-dHA序列的酵母表達(dá)載體p426GAL1。T4 DNA連接酶連接酶切后的載體與PCR產(chǎn)物，形成重組載體p426GAL1。隨后用BamHⅠ/PstⅠ雙酶切重組載體p426GAL1和含有35S-C4DDPK-CBF3-NOS片段的植物表達(dá)載體pGreen0029，得到ZmLTP3-dHA片段和表達(dá)載體，T4 DNA連接酶連接過夜，形成含有35S-C4DDPK-ZmLTP3-dHA-NOS片段的重組載體pGreen0029，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.2 ZmLTP3基因的轉(zhuǎn)化 將鑒定正確的質(zhì)粒用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌用花浸蘸法侵染擬南芥。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥的PCR檢測(cè) 轉(zhuǎn)基因擬南芥T0代的種子經(jīng)消毒后播在含50 μg/mL卡那霉素的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，挑選在抗性培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)的擬南芥植株提取基因組DNA，以DNA為模板，以ZmLTP3基因片斷內(nèi)部和載體片段的1對(duì)特異引物進(jìn)行PCR鑒定。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥的Western-blot檢測(cè) 取0.3 g經(jīng)PCR鑒定呈陽性的擬南芥幼嫩的葉片，加0.5 mL蛋白提取緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl，0.02% NaN3，0.001% PMSF，pH 8.0），液氮研磨后4 ℃、5 000 r/min離心10 min，吸取上清液，即得到總蛋白提取液。取適當(dāng)總蛋白提取液電泳，轉(zhuǎn)膜后以小鼠單克隆抗體Anti-HA（3f10）為一抗，Peroxidase-conjugated goat anti-rat IgG （H+L） 為二抗，進(jìn)行Western-blot 檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZmLTP3基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建

取BamHⅠ/PstⅠ酶切回收后的PCR片段和載體片段， 用T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，挑選陽性克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，所得的酶切片段與預(yù)期大小一致， 初步證明已經(jīng)連接成功。將質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序， 做進(jìn)一步驗(yàn)證，結(jié)果確認(rèn)了重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。ZmLTP3重組質(zhì)粒植物表達(dá)載體如圖1所示。

2.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥的鑒定

經(jīng)過測(cè)序鑒定正確的載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，攜帶表達(dá)載體的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥， 轉(zhuǎn)化后收取T0代種子， 播種在含有50 μg/L卡那霉素的MS培養(yǎng)基上。種子發(fā)芽后大多數(shù)幼苗子葉變黃，只有少部分幼苗仍然發(fā)綠，并且正常長(zhǎng)出真葉，保持正常的生長(zhǎng)狀態(tài)，這部分很有可能就是轉(zhuǎn)化了的幼苗（圖2）。

為了排除抗生素篩選過程中的假陽性必須對(duì)初步篩選出的抗性植株做進(jìn)一步的分子檢測(cè)。將在抗性培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)的T1代幼苗轉(zhuǎn)移到土壤中，待植株充分長(zhǎng)大，有足夠葉子時(shí)，取2～3片幼嫩的葉子提取基因組DNA，并以ZmLTP3基因與載體片段的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖3所示。野生型植株沒有擴(kuò)增出相應(yīng)條帶，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，抗性篩選出的幼苗也有假陽性。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因株系，經(jīng)過PCR 初步鑒定的株系，提取總蛋白，通過Western-blot進(jìn)一步在蛋白水平檢測(cè)基因的表達(dá)，結(jié)果如圖4所示。除了野生型植株沒有印跡條帶外， 其他PCR 陽性的株系在13 ku左右處均有特異條帶。結(jié)果表明， 這些株系為轉(zhuǎn)基因株系，轉(zhuǎn)化的目的基因在植物中得到了表達(dá)，沒有出現(xiàn)基因沉默現(xiàn)象。

3 小結(jié)

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